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【關(guān)鍵詞】生存素基因；細(xì)胞周期素B1基因；急性白血?。荒孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

ExpressionsofsurvivinandcyclinB1geneinchildhoodacuteleukemia

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionsandsignificanceofsurvivinandcyclinB1geneinchildhoodacuteleukemia(AL).METHODS:TheexpressionsofsurvivinandcyclinB1genewereexaminedbyRTPCRinbonemarrowcellsfrom42childrenwithincipientorrelapsedAL，13withcompletelyremissiveAL(ALCR)and15withoutmalignantdiseaseasacontrolgroup.RESULTS:InincipientandrelapsedALgroups,theexpressionlevelofsurvivinwere0.472and0.810,cyclinB1were0.606and0.739,whichwereremarkablyhigherthanthoseincontrolgroupandALCRgroup(P<0.01).TherewasasignificantlydifferencebetweenincipientALgroupandrelapsedALgroupintheexpressionlevelofsurvivinmRNA(P=0.025).Theexpressionofsurvivingenewasassociatedwithinitialwhitebloodcell(WBC)countandclinicaltypesofAL.TheexpressionofcyclinB1genewasnotcorrelatedwithage,sex,immunogenictype,initialWBCcountandclinicaltypesofAL.TherewasasignificantlypositivecorrelationbetweentheexpressionofsurvivingeneandcyclinB1inChildhoodAL(r=0.6864,P<0.01).Patientswithhighsurvivinexpressionlevelachievedalowerrateofcompleteremission(CR)thanthosewithlowexpressionlevelofsurvivin.CONCLUSION：SurvivinandcyclinB1geneareexpressedwidelyinspecimensofAL,andthereisapositivecorrelationbetweenthem.Overexpressionofsurvivinmayimplythelowersensitivityoftheleukemiccellstochemotherapyandthehigherriskofrelapse.Overexpressionofsurvivinmightbeanindexoftreatmenteffect,andmightberelatedtopoorprognosis.

【Keywords】survivin;cyclinB1;acuteleukemia;reversetranscriptionpolymerasechainreaction

【摘要】目的：探討基因生存素，細(xì)胞周期素B1的表達(dá)與兒童急性白血病（AL）的關(guān)系.方法：采用RTPCR對(duì)初治或復(fù)發(fā)AL患兒42例和完全緩解AL(ALCR)患兒13例及非惡性疾病患兒15例骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行基因生存素，細(xì)胞周期素b1表達(dá)的檢測(cè).結(jié)果：初治和復(fù)發(fā)AL組生存素mRNA表達(dá)水平分別為0.472和0.810，細(xì)胞周期素B1mRNA為0.609和0.739，均高于ALCR組（0）和對(duì)照組（0）（P<0.01）；復(fù)發(fā)AL組生存素mRNA表達(dá)水平高于初治組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.025）.生存素基因的表達(dá)與白細(xì)胞總數(shù)及臨床分型有關(guān)，與性別、年齡、免疫分型無(wú)明顯相關(guān)性.細(xì)胞周期素B1表達(dá)與性別、年齡、免疫分型、白細(xì)胞總數(shù)及臨床分型無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系.兒童AL中生存素與細(xì)胞周期素B1的表達(dá)呈正相關(guān).生存素mRNA表達(dá)水平高者緩解率低.結(jié)論：兒童AL中存在生存素，細(xì)胞周期素B1異常表達(dá)，兩者表達(dá)存在相關(guān)性.生存素是AL復(fù)發(fā)的高危因素；AL生存素高表達(dá)者可以降低AL的化療敏感性，生存素水平對(duì)AL有判斷療效和預(yù)后的價(jià)值.

【關(guān)鍵詞】生存素基因；細(xì)胞周期素B1基因；急性白血??；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

凋亡相關(guān)基因與白血病的治療及耐藥有關(guān).生存素是一種凋亡抑制蛋白，與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系［1］.細(xì)胞周期素B1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，它的異常表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，致使腫瘤形成.我們采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)的方法對(duì)初治、復(fù)發(fā)、化療后達(dá)完全緩解的急性白血病(acuteleukemia,AL)患兒以及對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞生存素基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，以探討生存素和細(xì)胞周期素B1基因與兒童急性白血病的關(guān)系及其臨床意義.

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象200402/200411AL患兒55（男36，女19）例，年齡2～14歲.其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)43例(L14例，L236例，L33例)，急性非淋巴細(xì)胞白血病(acutenonlymphocyticleukemia,ANLL)12例(M2a6例，M2b1例，M3a3例，M3b1例，M4b1例).初治35例，完全緩解(ALCR)13例，復(fù)發(fā)7例.初治組中ALL26例，其中BALL16例，TALL5例，5例未進(jìn)行免疫分型，ANLL9例.各組性別、年齡等條件相似.對(duì)照組15（男9，女6）例，年齡3～14歲.為同期住院非惡性血液?。ㄌ匕l(fā)性血小板減少性紫癜、缺鐵性貧血等）患兒.

1.2方法Trizol試劑（Gibco公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(Promega公司)，Taq酶（Sangon公司）；PCR擴(kuò)增儀（MJ公司220型）.抽取患者骨髓液1～2mL，ACD抗凝，采用Ficoll密度梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞(mononucleiccell,MNC)，采用Trizol試劑抽提并制備總RNA.cDNA的合成包括總RNA2μL(1g/L),oligo(dT)181.0μL，加ddH20至12μL，70℃反應(yīng)5min，冰上冷卻，加入5×Buffer4.0μL，RNasin核糖核酸酶抑制物1.0μL，10mmol/L的dNTPs2.0μL，37℃反應(yīng)5min，加MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200MU/L)1.0μL，終體積20μL，42℃反應(yīng)60min，70℃反應(yīng)10min后冰上冷卻完成反應(yīng).PCR擴(kuò)增生存素上游引物：5′ACCGCATCTCTACATTCAAG3′，生存素下游引物：5′CTTTCTTCGCAGTTTCCTC3′；細(xì)胞周期素B1上游引物：5′CCATTATTGATCGGTTCATGCAGA3′，細(xì)胞周期素B1下游引物：5′CTAGTGCAGAATTCAGCTGTGGTA3′；βactin上游引物：5′AAGAGAGGCATCCTCACCCT3′，βactin下游引物：5′TACATGGCTGGGGTGTTGAA3′.生存素?cái)U(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度342bp，細(xì)胞周期素B1擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度585bp，βactin擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度218bp.PCR反應(yīng)體系為25μL，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA2μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.50μL，10mmoldNTP0.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，生存素（或細(xì)胞周期素B1）上、下游引物,βactin上、下游引物各1.0μL（10μmol/L），TaqDNA聚合酶(83.35mkat/L)0.2μL，其余用水補(bǔ)足.生存素反應(yīng)條件為：94℃30s，54℃30s，74℃40s，30個(gè)循環(huán).細(xì)胞周期素B1反應(yīng)條件為：94℃60s，54.7℃60s，74℃40s，32個(gè)循環(huán).取擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，有目的基因擴(kuò)增片斷特異性條帶者的為陽(yáng)性，以無(wú)模板的PCR產(chǎn)物為陰性對(duì)照.利用GelDoc2000系統(tǒng)對(duì)凝膠圖像進(jìn)行分析，計(jì)算樣本生存素，細(xì)胞周期素B1基因PCR產(chǎn)物條帶光密度與βactinPCR產(chǎn)物條帶光密度比值，即為生存素，細(xì)胞周期素B1基因表達(dá)水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS10.0軟件包處理.生存素，細(xì)胞周期素B1基因的表達(dá)數(shù)據(jù)用中位數(shù)(P25～P75)表示，組間比較進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，對(duì)列聯(lián)表資料進(jìn)行相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

2結(jié)果

2.1生存素，細(xì)胞周期素B1mRNA的表達(dá)初治和復(fù)發(fā)組表達(dá)均高于對(duì)照組；緩解組和對(duì)照組表達(dá)無(wú)差異；復(fù)發(fā)組生存素表達(dá)高于初治組（圖1,2），復(fù)發(fā)組細(xì)胞周期素B1表達(dá)和初治組間無(wú)差異（表1）.ANLL患者生存素mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.536，ALL為0.450，兩者比較無(wú)顯著性差異（P=0.853）.ANLL細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.606，ALL為0.592，兩者的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.590）.表1兒童白血病生存素，細(xì)胞周期素B1mRNA的表達(dá)比較

2.2生存素，細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)與臨床特征初治AL組中生存素mRNA在WBC≥50×109/L患者表達(dá)水平為0.748，在WBC<50×109/L患者為0.442，兩者差異有顯著意義（P=0.019）.高危型患者生存素mRNA表達(dá)水平為0.699，低危型患者為0.433，兩者差異有顯著意義（P=0.010）.細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)在高危型和低危型患兒間、在WBC≥50×109/L和WBC<50×109/L患兒間差異無(wú)顯著性；生存素，細(xì)胞周期素B1mRNA在年齡≥10歲或<1歲與1～10歲患兒之間差異無(wú)顯著性；在男女間差異無(wú)顯著性；在TALL和BALL兩者差異無(wú)顯著性（表2）.對(duì)初治35例AL患者的生存素和細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者的mRNA表達(dá)成正相關(guān)（r＝0.6864，P<0.01，表3）.35例初治AL患者中13例可進(jìn)行療效評(píng)估（2例早期死亡，20例未治療）.10例獲得完全緩解（completeremission,CR）.獲得CR的患兒化療前生存素mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.473，細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.677，而未獲得CR的患兒化療前生存素mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.810，細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.606.提示生存素mRNA表達(dá)高的患者化療療效差、不易達(dá)到CR.，但尚需進(jìn)一步積累病例，以便分析生存素mRNA表達(dá)水平與急性白血病類型、療效的關(guān)系.7例復(fù)發(fā)的AL患者，只有2例用化療藥后達(dá)到CR，其生存素，細(xì)胞周期素B1mRNA表達(dá)均陽(yáng)性.余5例均未達(dá)到CR.表2兒童白血病生存素，細(xì)胞周期素B1的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

3討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素多階段相互作用的過(guò)程，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的失衡是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制.生存素基因表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡間存在明顯的負(fù)相關(guān)［2］.我們發(fā)現(xiàn)初治AL組和復(fù)發(fā)AL組中細(xì)胞普遍表達(dá)生存素基因，比完全緩解組和對(duì)照組骨髓細(xì)胞的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，完全緩解組生存素基因的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異，提示AL中生存素基因的表達(dá)可能阻礙了細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)了細(xì)胞的生存時(shí)間，使白血病細(xì)胞在體內(nèi)呈蓄積性增加，亦即兒童急性白血病的發(fā)生可能與抑制凋亡基因生存素的高表達(dá)有關(guān).生存素基因不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān)，而且與腫瘤耐藥、腫瘤預(yù)后不良也有關(guān)［3-6］.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組的生存素基因表達(dá)水平明顯高于初治組(P<0.01)；高危組AL患者的生存素基因表達(dá)水平明顯高于低危組AL患者，差異顯著（P<0.05）；在臨床療效比較中生存素高表達(dá)者臨床完全緩解率低于低表達(dá)者.提示生存素基因可能是兒童AL的一個(gè)高危因素，高表達(dá)生存素基因者易復(fù)發(fā)，臨床預(yù)后差，說(shuō)明生存素異常表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞臨床藥物的耐受.Takeno等［7］認(rèn)為細(xì)胞周期素B1是食管癌預(yù)后不良的指標(biāo).馬衛(wèi)東等［8］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期素B1高表達(dá)者的無(wú)病生存率高于正常表達(dá)者，說(shuō)明細(xì)胞周期素B1高表達(dá)對(duì)患者預(yù)后有積極意義，可作為預(yù)后較好的標(biāo)志.本研究表明AL細(xì)胞普遍表達(dá)細(xì)胞周期素B1基因，比完全緩解組和對(duì)照組骨髓細(xì)胞的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，完全緩解組的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異，復(fù)發(fā)組表達(dá)水平與初治組之間、高危組與低危組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05).提示兒童急性白血病的發(fā)生可能與細(xì)胞周期素B1表達(dá)有關(guān).

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