導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫好一篇微生物的多樣性，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公文云整理的十篇范文，供你借鑒。

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（保山中醫(yī)院高等?？茖W(xué)校，保山 678000）

（Baoshan College of Tranditional Chinese Medicine，Baoshan 678000，China）

摘要： SARS之后，中央空調(diào)系統(tǒng)可能成為傳染病的一種空氣傳播渠道引起公眾和政府的重視，而其獨(dú)特的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)亦為滋生各種微生物提供環(huán)境，所以加強(qiáng)對(duì)中央空調(diào)系統(tǒng)的衛(wèi)生評(píng)價(jià)和衛(wèi)生管理對(duì)于傳染病防控非常重要。本文闡述了保山地區(qū)疾病預(yù)防中心開(kāi)展在進(jìn)行中央空調(diào)系統(tǒng)衛(wèi)生狀況調(diào)查的同時(shí)開(kāi)展其微生物多樣性研究的意義。

Abstract： After SARS, that central air conditioning system may became an air spread channel of infectious diseases caused attention of public and government, and its unique design structure also provides environment for breeding various microorganism, so it is very important for infectious diseases control to strengthen the health evaluation and health management of the central air conditioning system. This paper expounds the meaning of microorganisms diversity research while investigating the hygienic condition of central air conditioning system in disease prevention center in Baoshan.

關(guān)鍵詞 ： 中央空調(diào)；微生物；多樣性

Key words： central air conditioning；microorganisms；diversity

中圖分類號(hào)：R122.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-4311（2015）02-0297-02

公共場(chǎng)所是人群密集場(chǎng)所，其衛(wèi)生狀況與人體健康密切相關(guān)。中央空調(diào)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于寫字樓、賓館、醫(yī)院等公共場(chǎng)所，通過(guò)對(duì)室內(nèi)空氣的溫度、濕度風(fēng)速等微小氣候進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，給人們的工作、學(xué)習(xí)和生活提供了舒適的環(huán)境，同時(shí)如果空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)在設(shè)計(jì)、安裝或者運(yùn)行管理等的過(guò)程中存在不合理的地方，很容易滋生室內(nèi)的空氣污染物，并且已經(jīng)成為了一種主要的建筑物室內(nèi)空氣污染?？照{(diào)系統(tǒng)對(duì)人體健康構(gòu)成的最大危害就是空調(diào)系統(tǒng)引發(fā)的傳染性疾病，其中“軍團(tuán)?。↙egionettosis）”是最具代表性的，曾在世界上很多國(guó)家引起50多起爆發(fā)流行；“不良建筑綜合癥（Sick Building Sgndrome，SBS）”是空調(diào)系統(tǒng)污染造成人體健康危害范圍最廣的，因此，全世界都很關(guān)注中央空調(diào)系統(tǒng)的衛(wèi)生問(wèn)題。

我國(guó)政府和公眾在2003年發(fā)生“SARS”后一直非常重視中央空調(diào)系統(tǒng)的衛(wèi)生問(wèn)題。衛(wèi)生部首先在2003年8月頒布了《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》，之后又在2006年2月頒布了《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》等四項(xiàng)規(guī)章制度，并于2006年3月1日起開(kāi)始實(shí)施，不僅規(guī)范了空調(diào)系統(tǒng)衛(wèi)生技術(shù)要求，也加強(qiáng)了空調(diào)系統(tǒng)衛(wèi)生評(píng)價(jià)規(guī)范與衛(wèi)生管理

在這一系列的衛(wèi)生法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的支持下，各地的疾病預(yù)防中心都開(kāi)展了相應(yīng)的工作[1]，對(duì)當(dāng)?shù)毓矆?chǎng)所的中央空調(diào)進(jìn)行了衛(wèi)生狀況的調(diào)查,調(diào)查結(jié)果根據(jù)相關(guān)規(guī)定列出細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)和檢出嗜肺軍團(tuán)菌、b-溶血性鏈球菌的情況，其中無(wú)一報(bào)告在進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，通過(guò)培養(yǎng)獲得的細(xì)菌和真菌具體有哪些種類及其數(shù)量分部。但是，建筑物內(nèi)的真菌孢芽、毒素的刺激能夠引發(fā)的病癥包括眼球和喉嚨的發(fā)癢、充血以及頭痛、呼吸困難，甚至哮喘等其他嚴(yán)重的疾病。有研究[2]表明，真菌是已與供暖、通風(fēng)和空調(diào)（HVAC）系統(tǒng)的污染相關(guān)的生物，它還可能導(dǎo)致生活在該環(huán)境下的人得傳染疾病。Somers等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吸入污染空氣顆粒的小鼠發(fā)生基因突變，這為空氣中的真菌可能導(dǎo)致肺癌提供了間接證據(jù)。室內(nèi)空氣生物污染不僅危害人體的呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，Anyanwu的研究證明產(chǎn)毒真菌的長(zhǎng)時(shí)間暴露可能影響到兒童神經(jīng)生理功能，上述研究部分揭示產(chǎn)毒真菌可能對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的健康也存在威脅，許多細(xì)菌的細(xì)胞成分（如內(nèi)毒素、β-葡聚糖）也是重要的病原，Huttunen[3]等研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)空氣中的細(xì)菌都顯著的誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞的腫瘤壞死因子-α、細(xì)胞白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生。而這些文獻(xiàn)中提到的微生物沒(méi)有在相關(guān)的檢測(cè)法規(guī)中作為需要檢測(cè)的對(duì)象出現(xiàn)。

所以僅僅調(diào)查和報(bào)告規(guī)定的細(xì)菌、真菌數(shù)量，只關(guān)注法規(guī)中提到的致病菌檢出情況就對(duì)一家公關(guān)場(chǎng)所中央空調(diào)的衛(wèi)生狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)是不夠全面的。

中央空調(diào)中的絕大多數(shù)微生物主要來(lái)源與空氣微生物，極少部分特別是條件致病菌或者病原微生物來(lái)源與入住的賓客或者工作人員。空氣微生物主要來(lái)源于土壤、水體表面、人體以及生產(chǎn)活動(dòng)等。其組成濃度不穩(wěn)定，種類多樣[4]?？諝馕⑸锏姆N類隨調(diào)查地理位置、調(diào)查季節(jié)的變化而有所不同。王春華[5]對(duì)東莞市5個(gè)不同的公共場(chǎng)所進(jìn)行空氣微生物監(jiān)測(cè)，細(xì)菌和真菌含量的季節(jié)更迭而變化。細(xì)菌以革蘭陽(yáng)性菌為主，其中芽孢桿菌和葡萄球菌占多數(shù)；真菌以青霉和曲霉為主。而中央空調(diào)的微生物多樣性調(diào)查結(jié)果尚無(wú)報(bào)道。

大多數(shù)空調(diào)系統(tǒng)在晚上停止新風(fēng)進(jìn)入后，整個(gè)風(fēng)道內(nèi)的濕度可達(dá)80甚至100，這樣一個(gè)特殊條件，為滋生各類微生物提供了適宜的生存繁殖環(huán)境，條件致病菌甚至是致病微生物都有可能在這樣的條件下得以生存。保山屬低緯山地亞熱帶季風(fēng)氣候，氣候類型的多樣化，生物種類繁多，微生物種類也很豐富，但其空氣微生物多樣性尚無(wú)相應(yīng)研究報(bào)道。曾有新聞報(bào)道，二戰(zhàn)期間，日軍在保山縣境內(nèi)發(fā)動(dòng)的細(xì)菌戰(zhàn)，曾引起霍亂、鼠疫、炭疽的爆發(fā)，這些都給保山的疾病預(yù)防和控制帶來(lái)了挑戰(zhàn)。對(duì)于人群集中的公共場(chǎng)所，容易引發(fā)、傳播傳染性疾病的空調(diào)系統(tǒng)的衛(wèi)生狀況調(diào)查和其中微生物多樣性的調(diào)查、研究都是刻不容緩的。所以結(jié)合本地的地理氣候、生態(tài)環(huán)境等因素，調(diào)查、研究哪些種類的微生物能夠在公共場(chǎng)所的中央空調(diào)中生存、繁殖或者是以孢子、芽孢等形式留存在中央空調(diào)中，中央空調(diào)中的微生物哪些可能是致病菌，哪些是可能條件致病菌，哪些僅僅是與空氣中的背景微生物。

檢測(cè)室內(nèi)空氣微生物，傳統(tǒng)的方法是利用生物粒子重力隨機(jī)沉降到培養(yǎng)皿上的暴皿沉降法，這種方法雖簡(jiǎn)單容易操作，但因?yàn)槭且粋€(gè)被動(dòng)捕獲的過(guò)程，所以結(jié)果波動(dòng)很大，準(zhǔn)確度和重復(fù)性都較差。對(duì)于中央空調(diào)的微生物采樣，現(xiàn)在更多采用為主動(dòng)抽取空氣的撞擊式采樣器，在計(jì)算微生物總數(shù)和對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定的同時(shí)測(cè)定其粒子大小分布規(guī)律。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)法只能培養(yǎng)可培養(yǎng)的微生物，而不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)或有其他生長(zhǎng)需求的微生物就不能獲得。另外，在進(jìn)行可培養(yǎng)微生物鑒定時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且不夠準(zhǔn)確，所以現(xiàn)在有生物發(fā)光法、免疫法等新方法引入到微生物多樣性的檢測(cè)中，其中分子生物學(xué)的方法具有寬闊的應(yīng)用前景。

中央空調(diào)微生物多樣性的研究不僅可以為制定更加全面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供微生物學(xué)的依據(jù)，還可以在空調(diào)系統(tǒng)樣品采集的方法、微生物種類的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、中央空調(diào)清潔的方法、頻率和注意事項(xiàng)、易感人群的感控提示等方面并提出微生物學(xué)的建議和意見(jiàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張志誠(chéng)，余淑苑，王秀英，等.22家酒店40套空調(diào)系統(tǒng)衛(wèi)生狀況調(diào)查[J].中國(guó)公共衛(wèi)生管理，2008，24（1）：88-90.

[2]SIMM0NS R B，CR0W S A．FungaJ colonization 0f air filters fbr use in heating， ventilating， and air conditioning(HVAC)systems[J]．J Ind Micmbio1，1995（14）：4l-45.

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【關(guān)鍵詞】生物多樣性 人口 生境的破碎化 環(huán)境污染 物種入侵

【中圖分類號(hào)】Q9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674－4810（2011）22－0175－02

1992年，聯(lián)合國(guó)在巴西召開(kāi)了環(huán)境與發(fā)展政府首腦會(huì)議，通過(guò)了《21世紀(jì)議程》，簽署了《生物多樣性公約》、《氣候變化框架條約》等，并達(dá)成了共識(shí)――走可持續(xù)發(fā)展的道路，從此生物多樣性受到人們的廣泛關(guān)注。

生物物種的滅絕是自然過(guò)程，但是滅絕的速度和方式，由于人類活動(dòng)對(duì)地球的影響而大大加速。有學(xué)者估計(jì)，自1600年以來(lái)，人類已導(dǎo)致75%的物種滅絕。

Reidh和Miller估計(jì)（1989年），鳥(niǎo)、獸兩類，1600～1700年間大約每10年滅絕一種；而1850～1950年期間，上升到大約每?jī)赡隃缃^一種。1600年以來(lái)的滅絕，古生物家稱為地質(zhì)史上的第六次大滅絕，它大約是已往地質(zhì)年代“自然”滅絕的100～1000倍。而加速的原因主要是由人類活動(dòng)的加劇而引起的。

由此看來(lái)，地球的生物多樣性正在受到越來(lái)越嚴(yán)重的破壞?，F(xiàn)就此進(jìn)行簡(jiǎn)單分析。

一 人口迅猛增加

社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展穩(wěn)定后，人口的數(shù)量就不斷增長(zhǎng)。在生產(chǎn)力落后時(shí)，人口的數(shù)量受到自然因素，如旱災(zāi)、蟲(chóng)災(zāi)、火災(zāi)、水災(zāi)、地震等的控制；另外，人類自身制造的災(zāi)難如戰(zhàn)爭(zhēng)、貧困也使得人口數(shù)量得以控制。但是，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使人的數(shù)量與壽命都延長(zhǎng)了。

19世紀(jì)工業(yè)革命后，人口的增加就成了全球的主流，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中國(guó)家最為明顯。1830年全球人口只有10億，1930年達(dá)到20億，2000年達(dá)到了60億。

中國(guó)在1790年的人口約3億，1860年約4億，1970年8億，到2000年就超過(guò)了13億人口。

人口增加后，必須擴(kuò)大耕地面積，滿足吃的需求，這樣就對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)及生存其中的生物物種產(chǎn)生了最直接的威脅。

由于人口增長(zhǎng)過(guò)快，加上等政策錯(cuò)誤，我國(guó)形成了大量的退化生態(tài)系統(tǒng)。目前，我國(guó)境內(nèi)水土流失面積約為180萬(wàn)平方公里，占國(guó)土面積的19%，其中黃土高原地區(qū)約80%地方水土流失。

北方沙漠、戈壁、沙漠化土地面積為149萬(wàn)平方公里，占國(guó)土面積的16%，1987年已沙漠化土地20萬(wàn)平方公里，潛在沙漠化土地13萬(wàn)平方公里

目前有5900萬(wàn)畝農(nóng)田和7400萬(wàn)畝草場(chǎng)受到沙漠化威脅。草原退縮面積13億畝，每年以2000萬(wàn)畝增加。每年使用農(nóng)藥防治面積23億畝，劣質(zhì)化肥污染農(nóng)田2500萬(wàn)畝。

二 生態(tài)環(huán)境的破碎化

生物多樣性減少最重要的原因是生態(tài)系統(tǒng)在自然或人為干擾下偏離的自然狀態(tài)，生境破碎，生物失去家園。

地球上許多生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性及其生境的損失，表現(xiàn)在面積劇烈減少，被改變或被破壞。濕地是被人類開(kāi)發(fā)最劇烈的系統(tǒng)之一。新西蘭有90%的濕地從歐洲殖民以來(lái)已經(jīng)損失。美國(guó)從1492年以來(lái)，幾乎100%的自然草地已損失，歐洲的溫帶森林已經(jīng)大部分被破壞。利用人造衛(wèi)星技術(shù)可以監(jiān)測(cè)全球森林的損失，估計(jì)是170000km2/a（1981～1990年之間）。

從生態(tài)系統(tǒng)多樣性喪失對(duì)人類社會(huì)的影響而言，今以我國(guó)1998年長(zhǎng)江洪水危害根源為例，長(zhǎng)江上中游森林破壞造成的水土流失和下游湖泊、濕地的圍墾和開(kāi)發(fā)導(dǎo)致調(diào)節(jié)洪水能力的減弱，無(wú)疑是其中的兩大重要原因，它們都與生態(tài)系統(tǒng)多樣的喪失有密切的關(guān)系。這個(gè)例子也說(shuō)明，要深入了解生物多樣性喪失的危害性，其關(guān)鍵是科學(xué)地理解生物多樣性的各種生態(tài)系統(tǒng)功能及其變化機(jī)理。

與自然系統(tǒng)相比，退化的生態(tài)系統(tǒng)種類組成變化、群落或系統(tǒng)結(jié)構(gòu)改變，生物多樣性減少，生物生產(chǎn)力降低，土壤和微環(huán)境惡化，生物間相互關(guān)系改變。

Daily（1995）對(duì)造成生態(tài)系統(tǒng)退化和生物多樣性減少的人類活動(dòng)進(jìn)行了排序：過(guò)度開(kāi)發(fā)（直接破壞和環(huán)境污染等）占35%，毀林占30%，農(nóng)業(yè)活動(dòng)占28%，過(guò)度收獲薪材占6%，生物工業(yè)占1%。其中前三項(xiàng)人類活動(dòng)占93%，而這些破壞最直觀的結(jié)果是造成了物種生境的破碎化，棲息地環(huán)境的島嶼化。

生物多樣性減少的程度取決于生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或過(guò)程受干擾的程度，例如，人類對(duì)植物獲取資源過(guò)程的干擾（如過(guò)度灌溉影響植物的水分循環(huán)，超量施肥影響生物地球化學(xué)循環(huán)）要比對(duì)生產(chǎn)者或消費(fèi)者的直接干擾產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)要大。

一般而言，在生態(tài)系統(tǒng)組成成分尚未完全破壞前排除干擾，生態(tài)系統(tǒng)的退化會(huì)停止并開(kāi)始恢復(fù)（例如少量砍伐后森林的恢復(fù)），生物多樣性可能會(huì)增加；但在生態(tài)系統(tǒng)的功能過(guò)程被破壞后排除干擾，生態(tài)系統(tǒng)的退化很難停止，而且還有可能會(huì)加?。ɡ缁馃降睾蟮牧值鼗謴?fù)）。

三 環(huán)境污染

隨著人類的發(fā)展，環(huán)境污染也逐漸加劇。環(huán)境污染會(huì)影響生態(tài)系統(tǒng)各個(gè)層次的結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)退化。環(huán)境污染對(duì)生物多樣性的影響目前有兩個(gè)基本觀點(diǎn)：一是由于生物對(duì)突然發(fā)生的污染在適應(yīng)上可能存在很大的局限性，故生物多樣性會(huì)喪失；二是污染會(huì)改變生物原有的進(jìn)化和適應(yīng)模式，生物多樣性可能會(huì)向著污染主導(dǎo)的條件下發(fā)展，從而偏離其自然或常規(guī)軌道。環(huán)境污染會(huì)導(dǎo)致生物多樣性在遺傳、種群和生態(tài)系統(tǒng)三個(gè)層次上降低。

第一，在遺傳層次上的影響。雖然污染會(huì)導(dǎo)致生物的抵抗并與之相適應(yīng)，但最終會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性減少。這是因?yàn)樵谖廴緱l件下，種群的敏感性個(gè)體消失，這些個(gè)體具有特質(zhì)性的遺傳變異因此而消失，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)種群的遺傳多樣性水平降低；污染引起種群的規(guī)模減小，由于隨機(jī)的遺傳漂變的增加，可能降低種群的遺傳多樣性水平；污染引起種群數(shù)量減小，以至于達(dá)到了種群的遺傳學(xué)閥值，即使種群最后恢復(fù)到原來(lái)的種群大小時(shí)，遺傳變異的來(lái)源也大大降低。

第二，在種群水平上的影響。物種是以種群的形式存在的，最近研究表明，當(dāng)種群以復(fù)合種群的形式存在時(shí)，由于某處的污染會(huì)導(dǎo)致該亞種群消失，而且由于生境的污染，該地方明顯不適合另一亞種群入侵和定居。此外，由于各物種種群對(duì)污染的抵抗力不同，有些種群會(huì)消失，而有些種群會(huì)存活，但最終的結(jié)果是當(dāng)?shù)匚锓N豐富度會(huì)減少。

第三，在生態(tài)系統(tǒng)層次上的影響。污染會(huì)影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)態(tài)。嚴(yán)重污染還可能具有趨同性，即將不同的生態(tài)系統(tǒng)類型最終變成基本沒(méi)有生物的死亡區(qū)。一般的污染會(huì)改變生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致功能的改變。值得注意的是，重金屬或有機(jī)物污染在生態(tài)系統(tǒng)中經(jīng)食物鏈作用，會(huì)有放大效應(yīng)，最終影響到人類的健康。

四 外來(lái)物種入侵

外來(lái)物種的入侵從字面上理解是增加了一個(gè)地區(qū)的生物多樣性，事實(shí)上，歷史上那些無(wú)害的生物也是通過(guò)人的努力而擴(kuò)大分布范圍的，一些馴化的作物或動(dòng)物已經(jīng)成人類的朋友，如我們食物中的馬鈴薯、西紅柿、芝麻、南瓜、白薯、芹菜等；樹(shù)木中的洋槐、英國(guó)梧桐、火炬樹(shù)；動(dòng)物飼料中的苜蓿；動(dòng)物中的紅鱒魚(yú)、海灣扇貝等，這些物種進(jìn)入到異國(guó)他鄉(xiāng)帶來(lái)的利益是大于危害的。

然而，對(duì)于生態(tài)平衡和生物多樣性來(lái)講，生物的入侵畢竟是一個(gè)擾亂生態(tài)平衡的過(guò)程，因?yàn)?，任何地區(qū)的生態(tài)平衡和生物多樣性都是經(jīng)過(guò)幾十億年演化的結(jié)果，這種平衡一旦打亂，就會(huì)失去控制而造成危害。

篇3

關(guān)鍵詞：土壤微生物；高通量測(cè)序；生物多樣性

中圖分類號(hào)：S154.37文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2013）08020303

1引言

土壤是一個(gè)非常復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境體系，土壤微生物學(xué)作為微生物學(xué)的一個(gè)分支，一直在研究之中。土壤微生物是土壤的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)中重要的消費(fèi)者和分解者，其群落結(jié)構(gòu)多樣性及變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量和穩(wěn)定性。土壤微生物多樣性是指微生物生命的豐富性及在遺傳、種類、生態(tài)系統(tǒng)層次上的變化，同時(shí)反映微生物群落的穩(wěn)定性。許多研究已經(jīng)證實(shí)， 通過(guò)傳統(tǒng)的DNA分離方法測(cè)定出來(lái)的土壤微生物只占到環(huán)境微生物的0.1%～10%[1， 2]。傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法如微生物平板培養(yǎng)法、Biolog鑒定系統(tǒng)法、生物標(biāo)記法等[3]往往會(huì)過(guò)低估價(jià)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，無(wú)法詳細(xì)描述出土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成方面的信息，也無(wú)法描繪出不同群體的生理差異。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的Sanger技術(shù)的弊端也日益體現(xiàn)，一方面是因?yàn)樵摲椒ㄙM(fèi)時(shí)，且一次的反應(yīng)數(shù)有限，另一方面是該技術(shù)基于酶法測(cè)序，成本較高。隨著微生物研究技術(shù)的迅速發(fā)展尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，土壤微生物學(xué)研究專家開(kāi)發(fā)出一系列的研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法[4]，高通量測(cè)序技術(shù)也隨之誕生，慢慢應(yīng)用到科研之中。

2土壤微生物研究方法

2.1微生物平板培養(yǎng)法

傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過(guò)一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現(xiàn)型來(lái)分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。這種方法只能培養(yǎng)出極少量的微生物類群，大約占0.1%～10%，無(wú)法對(duì)絕大多數(shù)土壤微生物的分類和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。因此這種培養(yǎng)法局限性比較大，只能應(yīng)用于特殊微生物的研究[5]。

2.2BIOLOG鑒定系統(tǒng)

BIOLOG系統(tǒng)是Garland于1991年建立起來(lái)的一套用于研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性方法。細(xì)胞的維持和生長(zhǎng)需要能量、碳源和多種無(wú)機(jī)離子，底物利用是群落中微生物存活和競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵。因此可以根據(jù)微生物對(duì)碳源利用的方式來(lái)鑒定微生物的群落結(jié)構(gòu)。碳數(shù)利用法通常用BIOLOG盤來(lái)實(shí)現(xiàn)。BIOLOG測(cè)試盤內(nèi)有96個(gè)小孔，除了一個(gè)小孔為對(duì)照不含碳源外，其余都含不同的碳源。試驗(yàn)中將碳源和指示劑一起放入平板小孔內(nèi)，然后將稀釋后的細(xì)胞懸液接種到各個(gè)小孔中，由于微生物利用碳源引起指示劑變化，以此來(lái)檢測(cè)和判斷不同土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[6]。

2.3分子生物學(xué)技術(shù)測(cè)序方法

在過(guò)去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)尤其16S rDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定未知菌類的研究中。20世紀(jì)80年代以來(lái)，逐步建立起了以分子系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、基因芯片（Microarry）、磷脂脂肪酸圖譜分析（ Phospholipid fatty acid， PLFA）、穩(wěn)定同位素探針（Stable Isotope Probing， SIP）、PCR-DGGE/TGGE等[7]，使得研究者能夠在分子水平上對(duì)土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。

但是這些技術(shù)只能在科或?qū)偎缴戏治鐾寥牢⑸锏娜郝浣Y(jié)構(gòu)，不能更細(xì)致更詳細(xì)地對(duì)土壤微生物進(jìn)行分析研究。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相繼出現(xiàn)了第一代、第二代、第三代高通量測(cè)序技術(shù)，使得研究人員能在種的水平上對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究和分析。

2.4 454高通量測(cè)序方法

高通量測(cè)序技術(shù)[8]是傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次可以對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，在有些文獻(xiàn)中也稱其為下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing），可見(jiàn)其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序。

近年來(lái)，以16S rRNA/DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)已成為普遍接受的方法。研究表明，400～600堿基的序列足以對(duì)環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進(jìn)行初步的估計(jì)[9]，因此454高通量測(cè)序的方法因其讀長(zhǎng)（400～500bp）長(zhǎng)和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)大量用于微生物多樣性的研究。

因此通過(guò)高通量測(cè)序法來(lái)確定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從而可以在種的水平上將土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)分析出來(lái)，然后就可以對(duì)土壤微生物的多樣性進(jìn)行分析。并可以對(duì)土壤微生物和鹽生植被的相互照應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析研究。

3454高通量測(cè)序在土壤微生物研究中的應(yīng)用

3.1研究土壤微生物的物種多樣性

研究微生物物種多樣性主要從微生物類群即細(xì)菌、真菌和放線菌這三大類群的數(shù)目及其比例來(lái)描述某個(gè)地區(qū)某段深度土壤中微生物的多樣性，然后根據(jù)此地區(qū)土壤微生物物種的多樣性來(lái)探究全球范圍內(nèi)土壤微生物的物種多樣性。通過(guò)高通量測(cè)序測(cè)得土壤中土壤微生物的各種菌類組成，以此來(lái)研究某個(gè)地區(qū)土壤中微生物的物種多樣性。

3.2研究土壤微生物的功能多樣性

研究土壤微生物功能多樣性主要從各種微生物的活性及它們的相互作用產(chǎn)生的功能、底物代謝能力及與N、P、K等營(yíng)養(yǎng)元素在土壤中相互轉(zhuǎn)化的功能等。通過(guò)將高通量測(cè)序得到的土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及組成和實(shí)驗(yàn)測(cè)定土壤的幾種理化性質(zhì)及轉(zhuǎn)化過(guò)程來(lái)了解土壤微生物的功能。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得土壤的堿解氮、有效磷、活性有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)理化性質(zhì)，可以分析地區(qū)土壤微生物的功能多樣性，以此來(lái)探究全球范圍內(nèi)土壤微生物乃至整個(gè)微生物的功能多樣性。

3.3研究環(huán)境的突然變化對(duì)土壤微生物菌群的影響

環(huán)境的突然改變會(huì)導(dǎo)致微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。近幾年來(lái)隨著全球變暖，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化，地震、泥石流等自然災(zāi)害也會(huì)對(duì)土壤微生物的群落構(gòu)成產(chǎn)生影響。Zachary等以重水穩(wěn)定同位素探測(cè)技術(shù)（H218O-SIP）鑒定與土壤增濕相關(guān)的細(xì)菌。先對(duì)土壤增濕前土壤微生物進(jìn)行測(cè)定，得到土壤微生物各種組成，然后將土壤增濕后，對(duì)土壤中16S rRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相對(duì)比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例則降低。作者通過(guò)控制土壤濕度的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)行研究，劃分生態(tài)類群。除此之外，溫度的驟變也會(huì)對(duì)土壤微生物菌群產(chǎn)生巨大的影響。

4454高通量測(cè)序技術(shù)存在的問(wèn)題及發(fā)

展前景到目前為止，大量的研究者應(yīng)用454測(cè)序技術(shù)對(duì)多種環(huán)境樣品的微生物多樣性進(jìn)行了深入研究，這些研究大大增長(zhǎng)了人類對(duì)微生物的存在和種類的認(rèn)識(shí)。針對(duì)不同的研究對(duì)象，454測(cè)序技術(shù)不僅為研究提供了大量數(shù)據(jù)，證實(shí)研究對(duì)象所含微生物具有較高的多樣性，而且還建立了一種研究復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)里的微生物多樣性方法。但由于該技術(shù)剛剛起步，所以存在一些待解決的問(wèn)題。首先，隨著核酸序列數(shù)量上的跨越式累積，生物信息學(xué)分析將面臨巨大的挑戰(zhàn)。另外，海量數(shù)據(jù)的深入挖掘工作會(huì)發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)生物學(xué)理論難以解釋的生命規(guī)律，對(duì)傳統(tǒng)理論的顛覆和新理論的提出與建立將成為不可避免的工作。

雖然存在許多不足，但454測(cè)序技術(shù)仍以其強(qiáng)大的測(cè)序能力滲透到生命科學(xué)研究的方方面面，包括那些此前無(wú)法用測(cè)序來(lái)解決的領(lǐng)域。在微生物領(lǐng)域，憑借著 454測(cè)序技術(shù)各方面的優(yōu)勢(shì)，終究會(huì)成為未來(lái)研究環(huán)境基因組的主導(dǎo)測(cè)序技術(shù)，同時(shí)，隨著454技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)將為微生物生態(tài)學(xué)研究注入新的動(dòng)力，成為微生物生態(tài)學(xué)研究新的亮點(diǎn)，大大加速微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，增長(zhǎng)人類對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的認(rèn)識(shí)，為人類探索廣袤的微生物資源提供無(wú)限遐想。參考文獻(xiàn)：

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篇4

（貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴陽(yáng) 550081）

摘要：采用T-RFLP法實(shí)驗(yàn)研究貴州省特有藥用植物根際叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多樣性。結(jié)果表明： 4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數(shù)量較大。植物種類不同，對(duì)應(yīng)的AMF群落多樣性有較大差異，證明了宿主植物對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響；同時(shí)，有機(jī)質(zhì)、pH和速效磷對(duì)根際AMF群落多樣性影響較大。

關(guān)鍵詞 ：叢枝菌根真菌；貴州特有藥用植物；群落多樣性

中圖分類號(hào)：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2015）17-0219-02

作者簡(jiǎn)介：封曄（1981-），女，陜西綏德人，貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，研究方向?yàn)槲⑸飸?yīng)用。

0 引言

貴州特有藥用植物是指目前在貴州省境內(nèi)發(fā)現(xiàn)有分布并具有藥用價(jià)值，但是在貴州以外的其它地區(qū)都沒(méi)有分布的物種，其代表種類有：銀背葉黨參、梵凈山小檗、梵凈山蒲兒根、梵凈山冠唇花、梵凈山火絨草、梵凈山紫苑、短莖羊藿等[1]。

菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有著重要的生態(tài)作用，它可以與世界上大多數(shù)的維管植物根系形成互惠共生體。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最廣泛的一類。研究表明，AMF因其能擴(kuò)大植物根系吸收面積、加快養(yǎng)分運(yùn)輸速率、分泌活化物質(zhì)、提高光合速率等直接和間接作用，改善宿主植物的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，增加植物中的碳積累，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]。

目前對(duì)藥用植物AMF的研究主要集中在菌根多樣性或接種菌根真菌對(duì)植物的影響。李品明等對(duì)重慶市13種中藥材植物的AMF物種多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，從中藥材植物根際土壤中分離出了10種菌根真菌，隸屬三個(gè)科[3]。王森等以山西歷山自然保護(hù)區(qū)暴馬丁香、連香樹(shù)、南方紅豆杉和領(lǐng)春木4種珍稀藥用植物為材料，從4種植物根際共鑒定AMF 27種[4]。在國(guó)內(nèi)因藥用植物種質(zhì)資源豐富，宿主范圍十分廣泛，目前已經(jīng)對(duì)上百種藥用植物進(jìn)行了研究。

長(zhǎng)久以來(lái)，中藥材大多來(lái)自野生藥用植物，但隨著對(duì)藥用植物需求的不斷增加，野生藥用植物已經(jīng)無(wú)法滿足人們對(duì)藥用植物的需求，甚至瀕臨滅絕，加之人工栽培技術(shù)落后、栽培措施不配套等原因，導(dǎo)致藥用植物種質(zhì)退化、質(zhì)量下降、入藥性質(zhì)不穩(wěn)定等。本課題主要是通過(guò)對(duì)貴州特有藥用植物根際土壤采集和分析，研究藥用植物根際AMF種質(zhì)資源及多樣性，以期為充分發(fā)掘和利用AMF資源，篩選AMF優(yōu)勢(shì)菌，利用菌根生物技術(shù)提高藥用植物產(chǎn)量、品質(zhì)和擴(kuò)大人工栽培區(qū)提供材料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

采樣地位于貴州東南部茂蘭保護(hù)區(qū)及織金縣牛場(chǎng)鎮(zhèn)。本區(qū)處于溫暖濕潤(rùn)的中亞熱帶氣候區(qū)，區(qū)域內(nèi)有雷公山和月亮山，分布著適宜常綠櫟林及熱帶常綠闊葉林生長(zhǎng)的紅壤和紅黃壤，海拔最高處為2178．8m，最低處137m。區(qū)域內(nèi)有中草藥資源十分豐富。

1.2 樣品采集

2014年10月在貴州省茂蘭保護(hù)區(qū)及織金縣牛場(chǎng)鎮(zhèn)采集鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黃連（Coptis chinensis Franch.）、太子參（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根際土。每株按東西南北4個(gè)方位，除去5cm厚的表層土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取帶有細(xì)根的根系，用塑膠袋存放根系和根際土樣品。經(jīng)檢測(cè)，土樣基本性質(zhì)如表1所示。

1.3 AMF的形態(tài)觀察及其侵染能力的檢測(cè)

采用Philips和Haymay染色方法進(jìn)行觀察和計(jì)算。

1.4 分子生物學(xué)方法分析樣品多樣性

1.4.1 總DNA的提取和純化

采用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤總DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

采用由大連寶生物公司合成的引物AM1 和NS31擴(kuò)增18SrDNA施測(cè)。反應(yīng)體系為20ml.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

1.4.3 群落多樣性分析

采用T-RFLP方法分析樣品，以圖譜中每一個(gè)限制性片段（T-RF） 為一個(gè)OTU，測(cè)定OTU數(shù)目即為物種豐富度指數(shù)（S），峰高值低于100熒光單位的峰不計(jì)入分析范疇。根據(jù)豐富度指數(shù)（S）和相對(duì)峰高值（Pi）測(cè)定均勻度指數(shù)（E） 和Shannon多樣性指數(shù)（H）。

相對(duì)峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N

均勻度指數(shù)（E）：E＝H/lnS

Shannon指數(shù)（H）：H＝－∑PilnPi

式中，N為該樣品所有累計(jì)峰高，ni為第i個(gè)T-RF峰值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入EXCEL（2003）、spss（V17.0）軟件系統(tǒng)進(jìn)行匯總和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際AMF的形態(tài)及其侵染率

從表2中可見(jiàn)，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四種植物中鐵皮石斛的菌根侵染率最高，丹參最低。對(duì)比采樣環(huán)境可以看出，侵染率與土壤性質(zhì)有一定相關(guān)性。其中pH越高侵染率越高；侵染率與速效磷和速效鉀呈反比。

2.2 群落多樣性

2.2.1 樣品總DNA提取和基因的擴(kuò)增結(jié)果

從土壤中提取出的總DNA粗提樣品中有大量黑褐色雜質(zhì)，基因組片段大小為20 kb，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，條帶明亮齊整，這說(shuō)明所得到的微生物總DNA比較完整。擴(kuò)增的18 SrDNA基因片段長(zhǎng)度為550 bp。

2.2.2 群落多樣性指數(shù)

表3可見(jiàn)，4個(gè)樣品的根際AMF多樣性存在明顯的差異。其中，豐富度指數(shù)和Shannon指數(shù)最高的是黃連，最低的是太子參，表明植物種類的差異對(duì)根際AMF群落多樣性有影響。

3 結(jié)論和討論

根際微生物活性及群落結(jié)構(gòu)的變化是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要指示因子，通過(guò)觀察其變化能夠發(fā)現(xiàn)植物和土壤質(zhì)量[6]。本研究表明，4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數(shù)量較大。由于植物種類的不同，AMF群落多樣性也存在很大的差異。由此可見(jiàn)，宿主植物也會(huì)影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。但Oehl具有不同意見(jiàn)，他認(rèn)為土壤類型和土地利用模式?jīng)Q定了AMF的群落結(jié)構(gòu)[8]。

對(duì)于根際微生物來(lái)說(shuō)，很多的環(huán)境因子都對(duì)其群落多樣性影響很大，如有機(jī)質(zhì)、pH和速效磷等，這是因?yàn)橥寥牢⑸镏械酿B(yǎng)分越高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就越多，這有利于其活性的增加。卜洪震等發(fā)現(xiàn)使用肥料后可以促進(jìn)土壤微生物的活性，并且不同施肥處理對(duì)土壤微生物量碳和微生物多樣性有著重要影響[7]。本研究中速效磷是影響AMF群落多樣性的一個(gè)主要因素。而從O’Donnell 等[8]學(xué)者的研究成果來(lái)看，土壤pH值也是一個(gè)重要的土壤微生物群落多樣性影響因子。徐輝[9]在現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上展開(kāi)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)速效磷也直接影響刺槐和沙棘根際AMF侵染率。在自然環(huán)境中隨著環(huán)境因子的變化，土壤微生物群落的形成和變化也會(huì)隨之調(diào)整，這說(shuō)明土壤微生物的生長(zhǎng)和環(huán)境因子有著直接關(guān)系。通過(guò)研究土壤微生物群落動(dòng)態(tài)變化，也就為了解生態(tài)系統(tǒng)的土壤健康狀況和植被發(fā)育階段提供了可能。

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篇5

[關(guān)鍵詞] 黃連；土壤；微生物；酶

黃連Coptis chinensis Franch屬毛茛科多年生草本植物，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效，廣泛用于腸道感染，對(duì)肺結(jié)核、猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道感染等也有一定療效，是傳統(tǒng)的大宗道地中藥材[1-2]。在黃連種植過(guò)程中，通過(guò)莖葉淋溶，根系分泌和植物殘?bào)w腐解等多種途徑向土壤中釋放小檗堿（berberine）、黃連堿（coptisine）、巴馬?。╬almatine）、藥根堿（jatrorrhizine）、甲基黃連堿（worenine）和表小檗堿（epiberberine）、小檗紅堿（berberrubine）等化感物質(zhì)[3]。其中，以小檗堿的分泌量最高，可達(dá)總分泌物的80%以上[4]。種植黃連后的土壤必須間隔2～3年才能再次種植，連作障礙極其嚴(yán)重。

相對(duì)于棉花-小麥-棉花輪作，棉花連作使土壤微生物種群數(shù)減少36.5%，種群結(jié)構(gòu)改變，多樣性指數(shù)顯著降低[5]；在牧草地和種植芒果的土壤中，微生物碳氮量和標(biāo)記性磷脂脂肪酸總量顯著高于菜地，各磷脂脂肪酸的含量也因種植作物不同而異[6]；集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)降低土壤有機(jī)質(zhì)，微生物種群減少，合理輪作能提供豐富多樣的有機(jī)質(zhì)，滿足不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要，微生物活性與種群數(shù)顯著高于單一種植[7]；在黃花蒿種植過(guò)程中，所釋放的青蒿素對(duì)土壤某些細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，土壤微生物的多樣性降低，種群結(jié)構(gòu)改變[8]；在種植丹參的根際土壤中，氨化細(xì)菌、固氮細(xì)菌、有機(jī)/無(wú)機(jī)磷細(xì)菌等顯著減少，但亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等微生物種群顯著增加。因此可見(jiàn)，種植植物對(duì)土壤微生物產(chǎn)生深刻影響。

目前，關(guān)于黃連根系分泌物對(duì)土壤微生物影響的研究甚少，導(dǎo)致對(duì)其連作障礙的成因認(rèn)識(shí)不足。此外，微生物是土壤酶的重要來(lái)源，其活性及種群對(duì)土壤酶產(chǎn)生潛在影響，而土壤酶催化土壤生物化學(xué)反應(yīng)，如氧化還原、有機(jī)質(zhì)降解、硝化與反硝化、腐殖質(zhì)合成等，故微生物活性、種群與土壤功能密切相關(guān)[8]。作者利用不同濃度的黃連須根浸提液，通過(guò)培養(yǎng)試驗(yàn)研究了它們對(duì)土壤微生物及酶活性的影響，為揭示黃連連作障礙發(fā)生機(jī)制積累了資料。

1 材料與方法

1.1 供試樣品 供試土壤為西南大學(xué)農(nóng)場(chǎng)的中性紫色土，質(zhì)地中壤、pH 6.68、有機(jī)質(zhì)20.03 g?kg-1、全氮3.32 g?kg-1、有效磷16.43 mg?kg-1、速效鉀119.8 mg?kg-1。采集0～20 cm耕作層，揀去雜物，風(fēng)干，過(guò)1 mm 篩，取250 g土壤于500 mL塑料杯中備用。

供試黃連須根（fibrous root extracts of Coptis chinensis，REC）購(gòu)自重慶市石柱縣黃連有限公司，小檗堿50.20 mg?g-1，（80±1） ℃烘干，粉碎過(guò)2 mm篩。準(zhǔn)確稱取20.00 g，加1 L蒸餾水37 ℃浸泡72 h后抽濾，濾液用去離子水定容至1 L備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 考慮到1 g?L-1黃連根莖浸提液可抑制幼苗生長(zhǎng)[4]，試驗(yàn)分別在供試土壤中加入0，6.25，9.375，12.5，25 mL黃連須根浸提液，即土壤中的黃連須根浸提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，500，750，1 000，2 000 mg?kg-1，相當(dāng)于小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，25，37.5，50，100 mg?kg-1，混合均勻。然后，加水至土壤最大田間持水量（24.29%）的（70±2）%，（25±1） ℃培養(yǎng)10 d。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目 利用稀釋平板分離計(jì)數(shù)法測(cè)定土壤中的細(xì)菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）、真菌（馬丁氏培養(yǎng)基）、放線菌（高氏一號(hào)培養(yǎng)基），自生固氮菌（Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基）、磷細(xì)菌（磷酸鈣+植酸培養(yǎng)基）、鉀細(xì)菌（鋁土礦培養(yǎng)基）、氨化細(xì)菌（蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）和硝化細(xì)菌數(shù)量（改良Stephenson培養(yǎng)基B）[9-11]，并通過(guò)形態(tài)和生理生化反應(yīng)等對(duì)自生固氮菌、磷細(xì)菌、鉀細(xì)菌、氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌數(shù)進(jìn)行鑒定確認(rèn)，包括革蘭氏和芽孢染色、好氧性測(cè)定，氧化酶、過(guò)氧化氫酶、MR和VP反應(yīng)，葡萄糖氧化、甘露醇和乳糖發(fā)酵，脲素、淀粉和明膠分解，以及 H2S 和吲哚產(chǎn)生、檸檬酸鹽、銨鹽、硝酸鹽、磷酸鹽利用等[12]。

土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸，0.5 mol?L-1 K2SO4 提取，提取液中的微生物碳和氮分別用K2Cr2O7氧化法和凱氏定氮法測(cè)定[13]。微生物磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acids，簡(jiǎn)稱PLFAs）的命名、提取和分析參照Frostegard和Kourtev方法[12]。將從土壤中提取并干燥的PLFAs溶解于正己烷中， 利用氣相色譜（Hewlett-Packard 6890）測(cè)定， 載氣為氦氣， 補(bǔ)償氣體為氮?dú)猓細(xì)怏w為空氣， 流量分別為20～30，30，300 mL?min-1， 初始溫度為70 ℃，保持1 min后，以20 ℃?min-1增加到150 ℃，再以5 ℃?min-1升至250 ℃，最后以10 ℃?min-1升至300 ℃。每個(gè)樣品運(yùn)行總時(shí)間31～32 min。依次采用3，5-二硝基水楊酸比色法、NH4+釋放量和TTC比色法測(cè)定土壤轉(zhuǎn)化酶、脲酶和脫氫酶活性[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理 用土壤PLFAs含量計(jì)算土壤微生物的種群特征值，包括多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)等。Shannom-Wiener多樣性指數(shù)H的計(jì)算公式為H =-∑Piln Pi，其中Pi= Ni/N， Ni為i PLFAs含量，N類微生物的PLFAs總量；Pielou均勻度指數(shù)J的計(jì)算公式為J =-∑PilnPi/lnS，S為PLFAs總含量；Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D的計(jì)算公式為D = 1-∑Pi2 [15]。

用Excel 2003對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計(jì)算，SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平設(shè)置為P

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量 隨著REC濃度的上升，土壤中的細(xì)菌、放線菌數(shù)量逐漸降低，而真菌則逐漸增加。當(dāng)REC達(dá)到2 000 mg?kg-1時(shí)，細(xì)菌數(shù)量約比對(duì)照減少62.07%，放線菌數(shù)量約比對(duì)照減少65.90%，真菌數(shù)量卻增加了約390.91%（表1）。

2.2 土壤磷細(xì)菌、鉀細(xì)菌、自生固氮菌、氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌數(shù)量 土壤中加入REC后，隨著濃度上升，土壤中的磷細(xì)菌、鉀細(xì)菌、自生固氮菌、氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的數(shù)量逐漸降低。在REC質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2 000 mg?kg-1時(shí)，它們的數(shù)量降低了62.50%～93.65%（表2）。

2.3 土壤微生物量碳、氮 土壤微生物量碳、氮的變化趨勢(shì)同土壤微生物數(shù)量，即隨著REC濃度提高，土壤微生物量碳、氮降低。當(dāng)REC質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2 000 mg?kg-1時(shí)，土壤微生物碳減少了57.48%；土壤微生物氮減少了71.63%。其中，微生物氮的降幅顯著大于微生物量碳，故微生物量碳氮比隨REC濃度提高而降低（圖1）。

2.4 微生物磷脂脂肪酸（PLFAs） 在REC 0，1 000，2 000 mg?kg-1的土壤中，分別檢測(cè)出25，22，18種標(biāo)記性PLFAs，包括代表細(xì)菌的11～19碳PLFAs，代表放線菌的10 Me 17：0和10 Me18：0，代表真菌的18：1ω9c，18：2 ω6，9，18：1ω9t，以及代表線蟲(chóng)的20：0（表3）。

從PLFAs總量看，對(duì)照最高，REC 1 000 mg kg-1土壤次之，2 000 mg?kg-1土壤最低，分別為1 260.3，1 091.6，971.4 μg?kg-1。在加入REC的土壤中，代表G+細(xì)菌的PLFAs降低了69.76%～82.61%，代表G-細(xì)菌的PLFAs降低了28.83%～51.86%，代表細(xì)菌的PLFAs總量降低了24.33～44.69%，代表線蟲(chóng)的PLFAs降低了38.22%～77.83%，代表真菌的PLFAs提高了25.91%～40.24%。

此外，REC處理土壤顯著降低i-15：0，α-15：0，i-16：0，i-17：0，2-OH 10：0，2-OH 12：0，3-OH 12：0，Cy17：0，Cy19：0，11：0，14：0，15：0，20：0等PLFAs含量，但顯著提高2-OH 14：0；13：0；18：2ω6，9；18：1ω9c；18：1ω9t等PLFAs含量，其余PLFAs變化不顯著。在不同濃度REC處理的土壤中，真菌與細(xì)菌PLFAs的比值依次為0.355（REC 0 mg?kg-1），0.606（REC 1 000 mg?kg-1），0.900（REC 2 000 mg?kg-1），即真菌/細(xì)菌隨REC濃度提高而增加。

2.5 微生物群落特征 利用PLFAs計(jì)算獲得的植煙土壤微生物種群特征值，其中，多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)對(duì)照最高，隨著REC濃度加高，多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)降低。但是優(yōu)勢(shì)度指數(shù)無(wú)顯著變化（表4）。

2.6 土壤酶活性 REC對(duì)土壤酶活性的影響表現(xiàn)出多樣性。隨REC濃度增加，轉(zhuǎn)化酶活性提高，當(dāng)REC達(dá)到2 000 mg?L-1時(shí)，其活性比對(duì)照提高了21.07%；脲酶活性降低，當(dāng)REC達(dá)到2 000 mg?L-1時(shí)，其活性比對(duì)照降低了26.47%；高低濃度的REC對(duì)脫氫酶活性無(wú)顯著影響，變化在1.71～1.74 μg?g-1?d-1（圖2）。

3 討論

黃連屬于多年生草本植物，從播種到收獲一般需要3～5年，根莖入藥，須根生長(zhǎng)旺盛。在長(zhǎng)期的生長(zhǎng)過(guò)程中，根系分泌和須根死亡使大量的內(nèi)含物進(jìn)入土壤，可能對(duì)土壤理化和生物學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生持續(xù)深刻的影響。

眾所周知，多樣性指數(shù)表示生物群落中的物種多寡，數(shù)值愈大表示群落中的物種越豐富；優(yōu)勢(shì)度指數(shù)越大，生物群落內(nèi)物種分異度越高[16]。一般而言，在穩(wěn)定良好的生態(tài)環(huán)境中，生物種群豐富，多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)較高，優(yōu)勢(shì)種群較多，分異度降低；反之亦然[17-18] 。在加入REC的土壤中，微生物多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)降低，說(shuō)明土壤環(huán)境不佳，不適合微生物的繁殖生長(zhǎng)，種群減少，密度降低。因此，從微生物生態(tài)學(xué)的角度看，加入REC惡化了土壤生態(tài)環(huán)境。

在加入REC的土壤中，微生物碳氮量顯著降低，說(shuō)明土壤微生物生長(zhǎng)繁殖總體上受到抑制。其中，細(xì)菌數(shù)量降低62.07%（培養(yǎng)計(jì)數(shù)），PLFAs從25種減少至18種，說(shuō)明REC抑制土壤細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，使細(xì)菌數(shù)量降低，種群減少。醫(yī)學(xué)研究也表明，黃連中的有效成分――小檗堿的抗菌譜較廣，對(duì)多種革蘭陽(yáng)性及陰性菌均具抑菌作用，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、幽門螺旋桿菌、滕黃微球菌、溶血性鏈球菌、霍亂弧菌、腦膜炎球菌、志賀痢疾桿菌、傷寒桿菌、白喉?xiàng)U菌等有較強(qiáng)的抑制作用，低濃度時(shí)抑菌，高濃度時(shí)殺菌 [19]。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，小檗堿立體結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類和喹諾酮類結(jié)構(gòu)疊合較好，提示小檗堿可能通過(guò)抑制細(xì)菌白體30S亞基或DNA回旋酶A產(chǎn)生抑菌作用。其中，小檗堿的季銨結(jié)構(gòu)是抗菌活性所必須的結(jié)構(gòu)，C2C3位的亞甲二氧基能增強(qiáng)抗菌活性[20]。但是，在加入REC的土壤中，真菌數(shù)量（培養(yǎng)計(jì)數(shù)）、生物量（以PLFAs計(jì)）顯著提高，但細(xì)菌/真菌顯著降低，說(shuō)明在土壤細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖受到抑制的情況下，打破了微生物群落之間的生態(tài)平衡，真菌可能獲得了生態(tài)優(yōu)勢(shì)而大量繁殖生長(zhǎng)，改變了土壤微生物群落的種群結(jié)構(gòu)。值得注意的是，在土壤真菌中，植物的病原真菌比例顯著高于細(xì)菌和放線菌，REC提高土壤真菌數(shù)量可能增加病原菌相對(duì)量，可能是黃連后續(xù)作物大量發(fā)生真菌病害原因之一[21]。

磷鉀細(xì)菌、自生固氮菌、氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌參與土壤磷鉀活化和氮素轉(zhuǎn)化，與土壤氮、磷、鉀“三要素”的生物有效性密切相關(guān)[22]。試驗(yàn)表明，REC顯著降低這些有益微生物的數(shù)量，故不利于固（供）氮、溶磷、解鉀。此外，多數(shù)自生固氮菌、磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌屬于根際促生細(xì)菌，能分泌生長(zhǎng)活性物質(zhì)，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、玉米素等，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[22]。因此，REC抑制這些有益微生物的生長(zhǎng)繁殖不僅直接減少土壤養(yǎng)分供應(yīng)，而且間接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。土壤微生物是土壤酶的主要來(lái)源，催化土壤中的各種生物化學(xué)反應(yīng)[23]。其中，脫氫酶參與土壤中的氧化還原反應(yīng)，可總體上指示微生物活性[24]；轉(zhuǎn)化酶參與蔗糖水解，關(guān)系到土壤有機(jī)質(zhì)降解[25]；脲酶與土壤氮素的生物有效性密切相關(guān)[25]。在加入REC的土壤中，脫氫酶活性無(wú)顯著變化，轉(zhuǎn)化酶活性提高，脲酶活性降低，說(shuō)明REC對(duì)土壤酶活性的影響表現(xiàn)出多樣性。據(jù)報(bào)道，植物根系分泌物可改變土壤硝酸還原酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等多種酶的活性，影響相關(guān)生物化學(xué)反應(yīng)[4]。微生物種群不同，所分泌的土壤酶也不一樣[26]。因此，土壤酶活性表現(xiàn)出多樣性變化實(shí)際上反應(yīng)了微生物不同種群對(duì)REC的敏感性不一樣。REC對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生的不同影響可能妨礙土壤生物化學(xué)反應(yīng)的有序，使土壤中的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化處于混亂狀態(tài)，造成土壤功能失調(diào)。

總之，REC顯著降低土壤細(xì)菌數(shù)量、生物量和種群，包括磷鉀細(xì)菌、自生固氮菌、氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌等多種有益微生物，但提高真菌數(shù)量；微生物群落多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)降低，土壤生態(tài)環(huán)境惡化；REC對(duì)土壤酶活性的影響表現(xiàn)出多樣性，可能破壞土壤生物化學(xué)反應(yīng)的有序，造成土壤功能失調(diào)。

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Effect of fibrous root extract of Coptis chinensis on soil

microbes and enzyme activities

LI Yang-bo， HE Lin-wei ， ZHANG Wei， WU Ye-kuan， YUAN Ling， HUANG Jian-guo*

（College of Natural Resources and Environment， Southwest University， Chongqing 400716， China）

[Abstract] Coptis chinensis is widely used as Chinese medicine herbs and serious soil problems occur after continual cultivation of this medicinal plant. In the preset experiment， fibrous root extract of C. chinensis （REC） was added into soil to study the effect of REC on microbes and enzyme activity in soil. The results showed that both bacteria and actinomycetes decreased by about 2 times in contrast to fungi，which increased by about 3 folds. Phosphorus bacteria， potassium bacteria， azotobacter， ammonia bacteria， and nitrifying bacteria were also reduced significantly by REC， suggesting the inhibition of nitrogen biofixation and supply， mobilization of phosphorus and potassium， ad plant growth promotion as REC added into soil. There were multiple influences of REC on soil enzyme activities. Invertase activity was stimulated， while urease was inhibited and dehydrogenase unchanged by REC， indicating the interference of biochemical reactions in soil. In addition， type and total content of phosphorus lipid fatty acids （PLFAs）， the signature of microbes， decreased while the ratio of bacterium to fungus PLFAs increased as REC increased in soil， which suggested that fungi increased relatively with bacteria decreased thereby leading to easy occurrence of crop fungus diseases following cultivation of C. chinensis. The decrease in diversity and evenness indexes of microbial community in soil by REC indicated soil ecosystem deterioration and reduction of microbial groups and densities in soil. Therefore， allelopathic chemicals released from the roots of C. chinensis could change microbial community structure and resulted in serious soil problems by continual cropping of this medicinal plant.

篇6

關(guān)鍵詞:宏基因組;不可培養(yǎng)微生物;篩選系統(tǒng)

中圖分類號(hào):Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1674-0432(2010)-06-0044-3

0 引言

Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先鋒研究工作給微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了革命性的變化。在此之前,人們完全沒(méi)有意識(shí)到真實(shí)存在于自然界和在實(shí)驗(yàn)室能培養(yǎng)的微生物數(shù)量之間重大的差別。伴隨著克隆和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,細(xì)菌通用引物對(duì)環(huán)境中生物群落總DNA的直接PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生了大量的數(shù)據(jù)并重新定義了原核生物的多樣性。近年來(lái)一些學(xué)者對(duì)微生態(tài)學(xué)和宏基因組進(jìn)行了研究。以下是近幾年報(bào)道的關(guān)于不可培養(yǎng)的大多數(shù)微生物的新的見(jiàn)解和技術(shù)。

1 宏基因組的研究

1.1 DNA的分離

環(huán)境樣品DNA的質(zhì)量直接關(guān)系到宏基因組分析的質(zhì)量。Tiedjie等發(fā)展了從不同類型的土壤中直接分離DNA 的方法,但是這些方法仍然不能確定在所有的具有代表性的高度復(fù)雜的生物群落中能夠獲取全部的總DNA。盡管Coutois等人發(fā)現(xiàn),從土壤中直接提取DNA和先從土壤分離細(xì)胞再?gòu)闹刑崛NA所得到的細(xì)菌多樣性范圍并無(wú)重大差別,但是Luna等人證實(shí),在檢測(cè)海水沉淀物時(shí),只用單一的DNA提取方法嚴(yán)重低估了細(xì)菌多樣性。不同的方法適用不同的環(huán)境。比如,Fortin等人發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞裂解前沖洗被碳?xì)浠衔锖椭亟饘賴?yán)重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的質(zhì)量。

選擇一種DNA提取方法用于宏基因組分析需要分析樣品的信息。在預(yù)測(cè)一個(gè)生態(tài)環(huán)境中不同的微生物群落成員的潛在功能的時(shí)候,分辨DNA來(lái)自樣品來(lái)自可培養(yǎng)的微生物還是來(lái)自死細(xì)胞是很有價(jià)值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指紋圖譜,提取處理過(guò)的樣品和未經(jīng)處理的樣品的DNA有重大的區(qū)別。對(duì)環(huán)境中的活體,很有必要區(qū)分DNA來(lái)自胞內(nèi)還是胞外。水沉淀中包含了大量來(lái)自胞外的DNA,Corinaldesi等人改進(jìn)了一種允許同時(shí)提取胞內(nèi)和胞外DNA的方法,這些DNA可能對(duì)細(xì)菌的新陳代謝起著重要的作用。

1.2 系統(tǒng)發(fā)生和宏基因組的分析

DNA提取方法的改進(jìn)、測(cè)序手段的進(jìn)步和測(cè)序成本的降低使我們能夠解決以下問(wèn)題:在一個(gè)群落中不連續(xù)的單元里共生多少種類的細(xì)菌以及環(huán)境中是什么因素影響著群落的組成和多樣性。Acinas等運(yùn)用不同的PCR擴(kuò)增方案建立了兩個(gè)獨(dú)立的沿海浮游生物的16S rRNA文庫(kù)。這兩個(gè)文庫(kù)的比較表明了PCR擴(kuò)增可能會(huì)高估文庫(kù)中獨(dú)特的rRNA序列。盡管如此,PCR的誤差仍然不能說(shuō)明樣品中的所有16S rRNA基因的微小差異(1%的序列差異)。97種已完全測(cè)序細(xì)菌全基因組比較表明,它們包含242種屬于非同源多操縱子的不同16S rRNA基因。序列分析還表明任何基因組中的16S rRNA內(nèi)部操縱子的差異在1%以內(nèi)。引入一個(gè)修正參數(shù)2.5(242個(gè)rRNA操縱子和97個(gè)基因組相除)到浮游生物樣品待測(cè)序的序列中,以99%的相似性(1113)為標(biāo)準(zhǔn),Acinas等預(yù)測(cè)這些樣品中至少包含了446種緊密相關(guān)的基因組。因此這些數(shù)據(jù)間接的表明了這個(gè)種群內(nèi)部包含有大量相似的種類?；蛐蛄幸查_(kāi)始用于推斷一個(gè)群落中各個(gè)體的角色和功能,這比僅確定群落中的種類更有意義和更具挑戰(zhàn)。

在低度多樣性環(huán)境中,普通的測(cè)序就能得到環(huán)境中的微生物信息。比如在一個(gè)種群細(xì)菌復(fù)雜程度不高的酸性礦井排水裝置中的生物膜中,可以對(duì)單個(gè)菌株的代謝途徑進(jìn)行分析。在Tyson等人的研究中,細(xì)菌種群只由五種主要的種類組成,而且其中兩種幾乎存在所有的覆蓋面積內(nèi)。而許多自然環(huán)境中種群結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜,不能采用現(xiàn)在的方法。據(jù)估計(jì)在一份農(nóng)場(chǎng)土壤樣品中有超過(guò)5000種,104-105株的細(xì)菌。要得到這些復(fù)雜環(huán)境中占有最優(yōu)勢(shì)地位的細(xì)菌種類的八倍的覆蓋量,必須產(chǎn)生二十億到五十億個(gè)堿基對(duì)的序列。為了避免對(duì)全基因組集合,Tringe等大量使用未集合的序列來(lái)讀取一定時(shí)期內(nèi)環(huán)境中標(biāo)記基因?；蚨堪▽?duì)特定生態(tài)環(huán)境能反映已知環(huán)境特點(diǎn)的環(huán)境樣品的分析。以基因比較為中心對(duì)特定環(huán)境中基因定位給我們更好地認(rèn)識(shí)和解釋環(huán)境帶來(lái)了新的機(jī)遇,也提出了新的問(wèn)題。

處理復(fù)雜環(huán)境的另一條途徑是將許多種類混合的16S rRNA基因克隆到單一的載體里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)發(fā)現(xiàn)了V1或V6高變區(qū)。這些位于核糖體小亞基rRNA上的高變區(qū)(叫做V1或V6區(qū))長(zhǎng)度大約為17-55bp,這些復(fù)雜的生物體中的片斷可以連接到單個(gè)的克隆里面去。用這種方法,單個(gè)測(cè)序反映能達(dá)到的序列標(biāo)記可達(dá)20個(gè)。這種方法可以鑒定菌群可達(dá)到屬的水平。van der Lelie等人報(bào)道了一種改變的序列標(biāo)記方法,用于基因組中短的保守序列,結(jié)合限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生標(biāo)記,可以區(qū)分親緣關(guān)系很近的菌株。一些細(xì)菌的保守基因已經(jīng)鑒定出來(lái),包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在這些基因中,16S rRNA是差別最大而且可以應(yīng)用于所有的原核生物種類分析的基因,可以達(dá)到屬的水平,很大一部分還可以分辯到種的水平。

近年來(lái),以16S rRNA基因?yàn)榛A(chǔ)的微生物分類陣列已經(jīng)成為鑒定微生物區(qū)系的最有力的方法。這種微生物分類陣列由大量不同門類的細(xì)菌的標(biāo)記探針組成。不同原型的陣列已經(jīng)發(fā)展并開(kāi)始用于估計(jì)環(huán)境種群中微生物的多樣性。這種以16S rRNA基因?yàn)榛A(chǔ)的微生物分類陣列將成為監(jiān)測(cè)各種復(fù)雜環(huán)境中微生物多樣性的一個(gè)最重要的工具。

復(fù)雜環(huán)境中微生物區(qū)系指紋圖譜和宏基因組分析將來(lái)可能發(fā)展為基因芯片。一個(gè)完全的綜合芯片到目前為止仍然是一個(gè)對(duì)未來(lái)的展望。Hong等人描述了一種基因芯片的概念,這種芯片通過(guò)分離不同種類和數(shù)量的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞并裂解提純DNA或者mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛐酒难芯繉?duì)我們認(rèn)識(shí)和監(jiān)測(cè)一定的微生態(tài)環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)的認(rèn)有著非常重要的意義。

直到今天,宏基因組的研究還只在生物量相對(duì)較高的環(huán)境中進(jìn)行。在對(duì)細(xì)胞、量很少的環(huán)境進(jìn)行宏基因組的分析還需要一種新的文庫(kù)構(gòu)建方法。Abulencia等描述了一種多態(tài)性擴(kuò)增嚴(yán)重污染的土壤中有機(jī)體基因組的方法。從嚴(yán)重污染和細(xì)胞密度極低的地表下土壤樣品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于擴(kuò)增總基因組。通過(guò)第一次基因組DNA的擴(kuò)增,污染的土壤中細(xì)菌多樣性分析,和細(xì)菌基因組文庫(kù)構(gòu)建是可能的。盡管存在擴(kuò)增的偏好現(xiàn)象,在一個(gè)微小的細(xì)菌樣品中擴(kuò)增宏基因組DNA,仍然可以得到一些以前無(wú)法得到的基因組的信息。

1.3 篩選宏基因組表達(dá)文庫(kù)

另外一種方法是通過(guò)構(gòu)建和篩選宏基因組表達(dá)文庫(kù),或者通過(guò)測(cè)序和限制性內(nèi)切酶的方法來(lái)篩選。直接篩選宏基因組文庫(kù)的一種局限就是需要超高通量的篩選系統(tǒng),或者大量的可用的篩選的陣列?？梢酝ㄟ^(guò)富集基因的方法來(lái)篩選由數(shù)百萬(wàn)個(gè)基因組成的宏基因組文庫(kù)中的稀有基因。其中一種富集的方法是底物誘導(dǎo)表達(dá)篩選(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一種高通量的SIGEX篩選方法,他們將目的基因和綠色熒光蛋白(GFP)連接起來(lái),轉(zhuǎn)到表達(dá)載體內(nèi),通過(guò)檢測(cè)激發(fā)的熒光來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的克隆。宏基因組DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通過(guò)FACS方法來(lái)排除所構(gòu)建文庫(kù)中組成型表達(dá)gfp的克隆。再將未表達(dá)gfp的克隆轉(zhuǎn)移到含有靶標(biāo)底物的培養(yǎng)基中,通過(guò)誘導(dǎo)gfp基因表達(dá)來(lái)篩選克隆子。這種篩選體系的機(jī)理是:分解代謝相關(guān)的基因能夠在特定代謝物的作用下被誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 通過(guò)培養(yǎng)方法獲取不可被培養(yǎng)的大多數(shù)微生物

要大量精確測(cè)序復(fù)雜環(huán)境中的微生物DNA樣品,不是一件很容易的事情,這也說(shuō)明了全面的獲取微生物信息的方法的重要性,可以通過(guò)這些信息來(lái)理解微生物間及微生物與環(huán)境間的相互作用。盡管“環(huán)境基因組”能夠提供大量的信息,但對(duì)生理學(xué),生態(tài)學(xué)和進(jìn)化學(xué)有重要影響的分類單元中可培養(yǎng)微生物單菌落的會(huì)給生態(tài)小環(huán)境的研究帶來(lái)深遠(yuǎn)影響。Proteorhodpsin的發(fā)現(xiàn)及它的編碼基因存在于Pelagibacter ubique證明了獲取可培養(yǎng)單菌落的作用。Proteorhodpsin編碼基因是在海水和環(huán)境微生物宏基因組的克隆測(cè)序過(guò)程工程中第一次被發(fā)現(xiàn)的,但是我們不能確定不可培養(yǎng)的微生物基因組中包含Proteorhodpsin基因。通過(guò)培養(yǎng)Pelagibacter ubique,我們就有可能將Proteorhodpsin與固定的種類聯(lián)系起來(lái)。

許多研究者們正在努力研究與模擬專一的可培養(yǎng)的微生物,并且利用將這些微生物來(lái)研究它們環(huán)境中所處的地位和發(fā)揮的作用。基因組測(cè)序已經(jīng)為我們提供了大量的信息并了解這些微生物在環(huán)境中的作用。

經(jīng)典的微生物培養(yǎng)策略都是一貫地給微生物系統(tǒng)提供過(guò)量的營(yíng)養(yǎng),從而導(dǎo)致能形成菌落或薄膜的和快速生長(zhǎng)的細(xì)菌富集。對(duì)于依賴稀釋培養(yǎng)基或模擬自然環(huán)境培養(yǎng)基才能生長(zhǎng)的細(xì)菌,Ferrari等人描述了一種模擬自然環(huán)境條件的用于培養(yǎng)土壤微生物的新穎方法。他們研究組所采用的泥漿膜系統(tǒng)中,一種聚碳酸酯是作為生長(zhǎng)培養(yǎng)支持物,土壤提取物作為培養(yǎng)基。研究結(jié)果是長(zhǎng)出了大量的未被鑒定的微型菌落。Koepke等人將多種不同的培養(yǎng)方法應(yīng)用到沿海地表下的沉積物,研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)情況下沒(méi)有一組微生物能夠在幾種培養(yǎng)方法中都被培養(yǎng)出來(lái)。他們的研究肯定了這個(gè)觀點(diǎn):沒(méi)有一種單一的培養(yǎng)方法或者培養(yǎng)基適用于分離專一樣本中的多種多樣的微生物。同時(shí)采用低營(yíng)養(yǎng)條件富集和分子方法,在冰島富含中性硫化物的熱溫泉中得到了具有一種高度差異型的淀粉酶基因。使用熱溫泉水的微生物富集方法采用低濃度淀粉和長(zhǎng)時(shí)間溫育,最后選育出能夠降解淀粉但生長(zhǎng)緩慢的微生物。

在培養(yǎng)之前,將樣品中的多種特定的微生物選擇性地分離出來(lái)可以降低微生物群落的復(fù)雜性。Miteva和Brenchley的過(guò)濾培養(yǎng),結(jié)合長(zhǎng)時(shí)間溫育,使一些新穎而極小的細(xì)胞菌落得到富集。這種方法對(duì)于研究極端條件下的微生物的代謝特性及長(zhǎng)時(shí)間存活機(jī)制是很有益的。

2 結(jié)語(yǔ)

要得到不可培養(yǎng)的大多數(shù)微生物的信息,還有很漫長(zhǎng)的路要走。在不久的將來(lái),使用更便宜更快捷的測(cè)序方法,環(huán)境工程測(cè)序技術(shù)將會(huì)產(chǎn)生更加多樣的數(shù)據(jù)和信息。然而,測(cè)序并非我們認(rèn)識(shí)環(huán)境微生物的唯一方法。我們需要一種新技術(shù),它能夠針對(duì)直接分析和估量環(huán)境和培養(yǎng)條件下的微生物細(xì)胞,并且盡可能地和自然界真實(shí)的狀況接近。對(duì)于單個(gè)微生物細(xì)胞進(jìn)行完全的特征分析也是一項(xiàng)很有意義的工作。雖然在當(dāng)今的條件下還沒(méi)能實(shí)現(xiàn),但是關(guān)于單細(xì)胞微生物學(xué)已是一個(gè)很明顯的趨勢(shì),能讓我們解決更多懸而未決未的環(huán)境微生物的問(wèn)題?？傊?在工程學(xué),生物地球化學(xué),生物化學(xué),生物信息學(xué),生理學(xué)和生態(tài)學(xué)等多種學(xué)科快速發(fā)展的基礎(chǔ)上,宏基因組學(xué)的研究將會(huì)使我們進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)于環(huán)境對(duì)微生物多樣性分析的理解和對(duì)微生物環(huán)境功能的認(rèn)識(shí)。

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篇7

如果有人向你提出這個(gè)奇怪的問(wèn)題，你也許會(huì)不假思索地回答：人類就是人呀！然而生物學(xué)家會(huì)告訴你，我們?nèi)祟?，就是人與寄存在人體軀殼內(nèi)的大量微生物共生的一個(gè)小小的生態(tài)系統(tǒng)。

通過(guò)基因測(cè)序研究人體微生物

早在300多年前，顯微鏡被發(fā)明后不久，科學(xué)家已觀察到人體內(nèi)存在微生物。然而，由于檢測(cè)、分析技術(shù)等的限制，人們無(wú)法大規(guī)模地獲取人體微生物群的構(gòu)成、功能等詳細(xì)信息，更無(wú)法進(jìn)一步了解這些數(shù)量龐大的微生物群與人體是如何相互作用的。

從人類基因組的破譯開(kāi)始，人們才真正對(duì)這些微生物有了比較深入的了解。2000年6月26日，當(dāng)美國(guó)總統(tǒng)克林頓與英國(guó)首相布萊爾共同宣布人類基因組計(jì)劃工作草圖完成時(shí)，整個(gè)世界都為之轟動(dòng)。圍繞著破譯“生命密碼”的研究，引起公眾的廣泛關(guān)注和討論。很多人曾認(rèn)為，只要讀懂人類基因組代表的“生命密碼”，人類的所有健康問(wèn)題將會(huì)迎刃而解。然而，越來(lái)越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，人體除受自身基因的調(diào)控外，還受到人身上大量的共生細(xì)菌的影響。

2007年底，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院正式啟動(dòng)為期5年的“人類微生物組計(jì)劃”，共投入經(jīng)費(fèi)1.4億美元。該計(jì)劃是繼“人類基因組計(jì)劃”完成之后一項(xiàng)規(guī)模更大的DNA測(cè)序計(jì)劃，也被稱為“人類第二基因組計(jì)劃”。其目標(biāo)是探索研究人類微生物組的可行性。通過(guò)繪制人體不同器官中微生物元基因組圖譜（包括細(xì)菌、病毒等微生物），解析微生物群結(jié)構(gòu)變化對(duì)人類健康的影響。同時(shí)，為其他科學(xué)研究提供信息和技術(shù)支持。我國(guó)作為參與者也一直積極推動(dòng)初期研究工作。

歐盟也有類似的研究項(xiàng)目，例如，作為人類元基因組第七框架項(xiàng)目的子項(xiàng)目，人類腸道宏基因組計(jì)劃就主要研究人類腸道中的所有微生物群落，進(jìn)而了解人腸道中細(xì)菌的物種分布，最終為后續(xù)研究腸道微生物與人的肥胖、腸炎等疾病的關(guān)系提供非常重要的理論依據(jù)。中國(guó)深圳華大基因研究院承擔(dān)了該計(jì)劃中的200多個(gè)歐洲人腸道微生物樣品的測(cè)序及后續(xù)生物信息分析工作。

這一系列研究項(xiàng)目正在揭開(kāi)人體微生物神秘的面紗。例如，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與失衡除了會(huì)導(dǎo)致腸道疾病外，還與糖尿病、肥胖等很多慢性全身性代謝性疾病有密切關(guān)系，甚至還與癌癥有關(guān)。微生物甚至還影響著機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟。越來(lái)越多的研究提示，人類健康與人體微生物息息相關(guān)，隨著人體與微生物之間的關(guān)系不斷得到闡明，人們對(duì)于人體本身的認(rèn)識(shí)、對(duì)于健康和疾病的認(rèn)識(shí)以及醫(yī)療模式都有可能隨之發(fā)生根本的改變。

研究發(fā)現(xiàn)微生物與人體健康息息相關(guān)

2010年3月4日，歐盟于2008年1月1日啟動(dòng)的人類腸道宏基因組計(jì)劃的研究小組公布階段性重大成果，引起世界的關(guān)注。該項(xiàng)研究成果收集了124個(gè)來(lái)自于歐洲人腸道菌群的樣本，采用了新一代大規(guī)模高通量的測(cè)序技術(shù)進(jìn)行深度測(cè)序，產(chǎn)出近6千億的堿基序列。經(jīng)過(guò)序列組裝和基因注釋分析，從中獲得330萬(wàn)個(gè)非冗余的人體腸道宏基因組的參考基因，大概是人自身基因的150倍。這個(gè)基因集中包含了絕大部分目前已知的人體腸道微生物基因，但更多的是目前未知微生物的基因。從這個(gè)基因集中可以估計(jì)人腸道中存在1000種至1150種細(xì)菌，平均每個(gè)人體內(nèi)含有約160種優(yōu)勢(shì)菌種，并且這些細(xì)菌是絕大部分個(gè)體所共有的。也就是說(shuō)，我們每個(gè)活著的人體內(nèi)都有大約100萬(wàn)億個(gè)微生物細(xì)胞，總重量約1.5千克。微生物細(xì)胞的數(shù)量是人體細(xì)胞的10倍，在人體的獨(dú)特基因中占99.9%。它們的構(gòu)成在很大程度上決定著人體的運(yùn)轉(zhuǎn)以及機(jī)能正?；蚴С！?/p>

美國(guó)人類微生物組計(jì)劃在2012年集中公布了第一批研究數(shù)據(jù)，來(lái)自多個(gè)國(guó)家的超過(guò)200名科研人員報(bào)道了他們5年來(lái)的研究成果。他們分析了242個(gè)美國(guó)健康志愿者微生物基因組，獲得了近800個(gè)菌種的基因參考序列。他們發(fā)現(xiàn)，來(lái)自牙齒和糞便的微生物樣本其類型和遺傳多樣性是最強(qiáng)的;來(lái)自皮膚和臉頰內(nèi)側(cè)樣本的多樣性次之;而來(lái)自陰道樣本的多樣性是最低的。

科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)，不同國(guó)家人群中的腸道微生物存在很多差異，差異最顯著的是微生物的多樣性程度。例如，印第安人和馬拉維人的腸道微生物組比美國(guó)人的腸道微生物具有更大的多樣性。有觀點(diǎn)認(rèn)為，微生物多樣性程度越高，人體越健康。該研究還發(fā)現(xiàn)，盡管來(lái)自三種不同地域人群的腸道微生物組存在很多差異，但它們之間也存在驚人的相似性。例如，三個(gè)不同國(guó)家的嬰兒微生物組形成過(guò)程具有共同的模式，即嬰兒需要6個(gè)月至9個(gè)月的時(shí)間來(lái)獲得第一組600～700個(gè)細(xì)菌，然后再經(jīng)過(guò)幾年的時(shí)間才能獲得成人的微生物組。該研究還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，即腸道微生物組的構(gòu)成會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生改變，而這一變化恰恰適應(yīng)了不同年齡段人體的需求。

同時(shí)，人體微生物還與免疫系統(tǒng)有著密切的關(guān)系。2012年4月，日本科學(xué)家在《科學(xué)》報(bào)告，發(fā)現(xiàn)一種免疫抑制性受體控制著腸道菌群的構(gòu)成，如果這種受體缺失，腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境就會(huì)紊亂，會(huì)導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)過(guò)度活躍，進(jìn)而有可能出現(xiàn)自身免疫性疾病等病態(tài)變化。研究者認(rèn)為，這些新發(fā)現(xiàn)有望幫助開(kāi)發(fā)預(yù)防或緩解自身免疫性疾病癥狀的新方法。同期《科學(xué)》的另一項(xiàng)研究也提示，在生命早期接觸微生物可以減少哮喘或炎癥性腸病等疾病的發(fā)生。

人類腸道菌群與肥胖

隨著科學(xué)家們研究的深入，我們對(duì)人類體內(nèi)的微生物，尤其是腸道內(nèi)的菌群，有了更多的了解。人類的消化系統(tǒng)實(shí)際上是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，成百上千種細(xì)菌在那里開(kāi)展各種活動(dòng)，比如，讓未消化的碳水化合物發(fā)酵、提供維生素，等等。它們還能調(diào)節(jié)你身體儲(chǔ)存的脂肪量。

不過(guò)，并非每個(gè)人都有同樣的腸道菌群。而且，有趣的是，菌群的組成與肥胖有關(guān)。當(dāng)然，這種關(guān)系可能很簡(jiǎn)單，胖人的飲食不同，所以，他們的腸道菌群也不同。

2013年《科學(xué)》雜志發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，這種因果關(guān)系也有可能顛倒過(guò)來(lái)。研究人員從一些雙胞胎小鼠身上取出細(xì)菌，雙胞胎中有一只肥胖，另外一只不胖。然后，他們將細(xì)菌移植到不同的小鼠身上。接受了肥胖雙胞胎菌群的小鼠體重增加了，其他小鼠則不然。這些小鼠的進(jìn)食沒(méi)有增加：是它們的新陳代謝變化導(dǎo)致了體重增加，即使攝入的熱量不變。

那么，是什么決定了你的腸道菌群呢？有可能是抗生素、環(huán)境毒素或食品的加工方式?！缎掠⒏裉m醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，肥胖似乎能在社交網(wǎng)絡(luò)中“傳染”，讓朋友和鄰居感染上肥胖。我們以前一直認(rèn)為，那是物以類聚、人以群分的結(jié)果―這也確實(shí)是部分原因。不過(guò)，會(huì)不會(huì)是腸道菌群也可以在非常親密的人之間傳播，所以，肥胖或許真的可以傳染？

生物因素和行為因素之間往往存在相互作用，比如流感的傳播就跟我們是否勤洗手關(guān)系巨大。同樣地，這項(xiàng)對(duì)細(xì)菌的研究也發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)小鼠的飲食中含有大量飽和脂肪時(shí)，“肥胖腸道菌群”才會(huì)起到作用。

最有趣的大概是，改變生物因素甚至可以改變?nèi)说挠?。一些生物學(xué)家推測(cè)，我們的腸道細(xì)菌其實(shí)驅(qū)動(dòng)了我們對(duì)某些不健康食品的渴求。所以，重視生物因素并不等于淡化行為因素，而是意味著從更多的維度理解它。

我們身上的微生物正在發(fā)生變化

關(guān)于人類和與人類共存的微生物，正在發(fā)生一些值得我們憂慮的變化。就像全世界的生態(tài)系統(tǒng)一樣，人類微生物菌群正在失去它們的多樣性，以至于可能會(huì)損害它們所寄居的主體的健康。

紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院傳染病專家、 人類微生物組計(jì)劃負(fù)責(zé)人馬丁?J?布拉澤博士在過(guò)去30多年間，一直研究細(xì)菌在疾病中發(fā)揮的作用。除傳染病外，他的研究范圍還囊括了自體免疫疾病，以及其他在世界范圍內(nèi)急劇增加的疾病。

布拉澤在他的新書(shū)《消失的微生物》中表示，微生物組多樣性的減少導(dǎo)致我們更容易感染嚴(yán)重且通常都是慢性的疾病―從過(guò)敏、乳糜瀉到一型糖尿病和肥胖癥。布拉澤及其他人認(rèn)為，這主要是由抗生素造成的。

布拉澤表示，抗生素很早就開(kāi)始對(duì)微生物多樣性產(chǎn)生破壞。普通的美國(guó)兒童在出生的頭兩年要接受大約3個(gè)療程的抗生素，在接下來(lái)的8年里，要再進(jìn)行8個(gè)療程。很短療程的抗生素治療就能致使人體的微生物環(huán)境發(fā)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變，比如，被廣泛使用的阿奇霉素。

抗生素并不是破壞平衡的唯一因素。布拉澤接受采訪時(shí)表示，近幾十年，選擇剖腹產(chǎn)的人激增，剖腹產(chǎn)促使嬰兒內(nèi)臟中的微生物來(lái)自母親的皮膚，而不是產(chǎn)道。

微生物組的變化能夠改變嬰兒的新陳代謝和免疫系統(tǒng)。最近，研究人員查閱了15項(xiàng)共涉及16.3796萬(wàn)個(gè)分娩案例的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與順產(chǎn)的嬰兒相比，剖腹產(chǎn)嬰兒成人后超重的幾率要高26%，肥胖的風(fēng)險(xiǎn)要高22%。研究人員發(fā)現(xiàn)，人的胎盤有自己的微生物組，這個(gè)微生物組可能也有助于嬰兒的內(nèi)臟健康，減少由剖腹產(chǎn)引發(fā)的微生物損耗。

其他研究發(fā)現(xiàn)了正常體重者與肥胖者腸道中微生物的主要差異。雖然這些研究不能說(shuō)明最先出現(xiàn)的是那個(gè)問(wèn)題―體重問(wèn)題或微生物組的變化，但研究說(shuō)明，肥胖的老鼠體內(nèi)存在能夠更好地從食物中吸取熱量的腸道菌群。與肥胖相關(guān)的進(jìn)一步證據(jù)來(lái)自農(nóng)場(chǎng)里的動(dòng)物。在美國(guó)出售的抗生素中，大約有3/4都用在牲畜身上。這些抗生素改變了動(dòng)物的微生物菌群，加快了它們的生長(zhǎng)速度。布拉澤說(shuō)，當(dāng)我們把用于牲畜的抗生素用在老鼠身上時(shí)，它們的新陳代謝就會(huì)發(fā)生改變，并促使它們的體脂增加。

更嚴(yán)重的是，如今有越來(lái)越多嚴(yán)重的功能失調(diào)都與人類內(nèi)臟的微生物平衡被破壞有關(guān)。其中，有多種功能失調(diào)在發(fā)達(dá)國(guó)家中變得越來(lái)越常見(jiàn)，如克隆氏癥、潰瘍性結(jié)腸炎和乳糜瀉胃腸疾病等;心血管疾病;非酒精性脂肪肝;慢性反流癥等消化失調(diào)問(wèn)題;多發(fā)性硬化和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自體免疫性疾病以及哮喘和過(guò)敏。

有些研究人員甚至推斷，內(nèi)臟微生物菌群失調(diào)是造成乳糜瀉的原因，所以，甚至連沒(méi)患這種病的人對(duì)無(wú)麩質(zhì)食物的需求也會(huì)激增。乳糜瀉舊稱非熱帶脂肪瀉，又稱乳糜腹瀉、麥膠引起的腸?。ê?jiǎn)稱麥膠腸?。Ｈ槊訛a是一種具有遺傳性的發(fā)生于小腸的自身免疫性疾病，從嬰兒到各年齡段的人都會(huì)罹患。乳糜瀉的癥狀包括慢性腹瀉，生長(zhǎng)遲滯（兒童）和疲勞，但有些人癥狀不明顯。在北美、北歐、澳大利亞發(fā)病率較高，我國(guó)國(guó)內(nèi)很少見(jiàn)。

布拉澤和其他研究人員，還有來(lái)自瑞士和德國(guó)的一組研究人員也認(rèn)為，哮喘患病率的大幅上升與“幽門螺桿菌從西方社會(huì)快速消失有關(guān)”。眾所周知，幽門螺桿菌是一種長(zhǎng)期寄存在人類胃里的細(xì)菌性病原體。曾幾何時(shí)，幾乎每個(gè)人體內(nèi)都有這種細(xì)菌，歐洲研究者已經(jīng)證明，它能防止老鼠出現(xiàn)過(guò)敏性哮喘的癥狀。在人生命的早期階段，幽門螺桿菌的存在能促使血液中產(chǎn)生T細(xì)胞。布拉澤表示，壓制過(guò)敏反應(yīng)就需要這種細(xì)胞。他的研究表明，雖然有些類型的幽門螺桿菌與消化性潰瘍和胃癌有關(guān)，但其他類型則具有保護(hù)作用。布拉澤和同事的研究進(jìn)一步表明，胃部的幽門螺桿菌能夠防止胃食管返流疾病、巴雷特氏食管（食管下端有不正常的柱狀上皮覆蓋，稱之為巴雷特氏食管。普遍認(rèn)為是后天獲得的，并與反流性食管炎密切相關(guān)，并有發(fā)生腺癌的可能）和食道癌。

研究者不是總能說(shuō)明腸道菌群紊亂會(huì)在人們生病之前還是之后出現(xiàn)。不過(guò)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的研究往往表明，菌群紊亂會(huì)發(fā)生在生病之前。

篇8

【關(guān)鍵詞】人工濕地；微生物；種群特征；人工調(diào)控

人工濕地是一種集環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益于一體的污水處理技術(shù)。該技術(shù)是通過(guò)人工建造、模擬自然濕地的綜合性生態(tài)體系，利用人造生態(tài)系統(tǒng)中的物理、化學(xué)和生物的協(xié)同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)污水的凈化。在濕地系統(tǒng)中，微生物群落是去除有機(jī)物和脫氮除磷的主要承擔(dān)者，越來(lái)越多的證據(jù)表明，微生物是人工濕地處理污水過(guò)程的重要指標(biāo)。因此，探索和研究濕地系統(tǒng)中微生物的種群特性，對(duì)了解人工濕地的去污機(jī)理以及研究微生物群落的人工調(diào)控技術(shù)具有重要意義。

1.濕地微生物種群研究現(xiàn)狀

1.1濕地微生物多樣性分析

微生物多樣性的研究主要是通過(guò)對(duì)濕地微生物的分離、鑒定來(lái)進(jìn)行的。在人工濕地系統(tǒng)中，以細(xì)菌數(shù)量為最多，其次為放線菌，真菌數(shù)量最少。細(xì)菌又包括好氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌及磷細(xì)菌等。夏宏生等研究發(fā)現(xiàn)，氨化細(xì)菌是除氮的優(yōu)勢(shì)菌群，隨著人工濕地的運(yùn)行，其數(shù)量逐漸增加；硝化細(xì)菌屬于好氧細(xì)菌，隨著人工濕地的連續(xù)運(yùn)行數(shù)量有所下降；反硝化細(xì)菌受外界氣溫影響較大，隨著氣溫的逐漸升高，其細(xì)菌數(shù)量逐漸上升。魏成等認(rèn)為，混合種植植物模式的人工濕地系統(tǒng)可獲得較高的根際微生物功能多樣性，從而提高濕地系統(tǒng)凈化效率及其穩(wěn)定性。蔣玲燕等研究表明，植物對(duì)微生物多樣性的作用要優(yōu)于填料；而多種植物系統(tǒng)與多種填料系統(tǒng)在有機(jī)物降解和營(yíng)養(yǎng)物去除方面均比單一植物與單一填料系統(tǒng)有優(yōu)勢(shì)，從而表現(xiàn)出更高的去污效率。

1.2濕地微生物群落分布特征

微生物群落結(jié)構(gòu)，即微生物不同類群的相對(duì)豐度，可通過(guò)各微生物類群的特征脂肪酸的相對(duì)含量表征。吳振斌認(rèn)為，濕地基質(zhì)中好氧原核微生物為優(yōu)勢(shì)類群，其次為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及其他厭氧細(xì)菌，真核微生物所占比例最低。Zhou等人的研究發(fā)現(xiàn)，濕地基質(zhì)表層的細(xì)菌與真菌的數(shù)量顯著高于其下層的數(shù)量，隨著系統(tǒng)的垂直高度不斷加深，真菌的數(shù)量逐漸減少。張政等人采用潛流水平濕地系統(tǒng)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，沿水流方向細(xì)菌、亞硝酸菌總數(shù)的總體趨勢(shì)是遞減的，即前部多于中后部；在垂直方向上，上層的微生物數(shù)量多于下層。

1.3濕地微生物酶及其活性研究

濕地系統(tǒng)中酶的活性是微生物功能的一種體現(xiàn)，其活性高低直接影響著污水的凈化效果。李智等測(cè)定了人工濕地酶活性，發(fā)現(xiàn)人工濕地基質(zhì)中酶活性下行池大于上行池，基質(zhì)上層磷酸酶、脲酶和蛋白酶的活性顯著大于中下層基質(zhì)；不同時(shí)間的基質(zhì)酶活性不同。何起利等研究發(fā)現(xiàn)，濕地中的氧化酶活性表現(xiàn)為表層高于中下層；而硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶等活性變化趨勢(shì)則相反；同時(shí)，多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶、脫氫酶等氧化酶活性也與氧化還原電位存在顯著正相關(guān)，而與下行流池的硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶等還原酶類存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。吳振斌等認(rèn)為，不同月份、不同深度濕地基質(zhì)酶活性不相同；不同濕地類型其酶活性也不相同；脲酶活性與濕地系統(tǒng)凱氏氮的去除率之間存在顯著相關(guān)性。綜上所述，人工濕地中各種酶活性會(huì)受到空間、污染負(fù)荷、污染物類型等因素的影響，因此可通過(guò)改變?nèi)斯竦氐耐獠織l件來(lái)調(diào)控胞外酶使其達(dá)到最佳的處理污水的狀態(tài)。

2.濕地微生物調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展

濕地微生物調(diào)控是指在研究濕地微生物的種群特征及酶活性的基礎(chǔ)上，通過(guò)控制影響微生物分布及活性的各種因素（如溫度、碳源、溶解氧等），以達(dá)到提高人工濕地處理污水效率的一種技術(shù)。通過(guò)人工調(diào)控強(qiáng)化濕地微生物對(duì)污染物的降解能力對(duì)人工濕地的高效運(yùn)行十分重要。

2.1水溫

溫度變化不僅影響濕地系統(tǒng)中微生物的代謝速率，而且還影響到其他重要環(huán)境因子，這些因子往往會(huì)影響到微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。有報(bào)道稱，當(dāng)溫度在10℃左右時(shí)，硝化速率比較穩(wěn)定；但低于10℃，人工濕地系統(tǒng)處理效果會(huì)明顯降低；當(dāng)溫度在5℃以下時(shí)，反硝化過(guò)程就很難發(fā)生；而若溫度過(guò)高，在30℃以上時(shí)，硝化與反硝化過(guò)程均會(huì)受到抑制。濕地系統(tǒng)中微生物的種類和數(shù)量會(huì)隨季節(jié)的改變而變化，一般情況下，夏秋季數(shù)量最高，冬季最少。雒維國(guó)等對(duì)濕地植物采用多層PVC透氣薄膜進(jìn)行保溫，可增加濕地系統(tǒng)溫度，從而提高了COD、TN和TP的去除率。

2.2碳源

微生物的新陳代謝過(guò)程受碳源影響較大，可以說(shuō)碳源代謝功能是濕地微生物活性的重要表征，也是影響生物脫氮過(guò)程的關(guān)鍵因素。對(duì)于低碳氮比污水，則需要在濕地系統(tǒng)中補(bǔ)充碳源，為反硝化過(guò)程提供充分的電子供體，強(qiáng)化濕地脫氮功能。趙聯(lián)芳等在用葡萄糖調(diào)節(jié)進(jìn)水C/N達(dá)到8時(shí)，TN去除率由未補(bǔ)充碳源之前（C/N=2）的55%升高到89%。佘麗華等指出，向人工濕地系統(tǒng)中投加葡萄糖作為外加碳源提高系統(tǒng)的反硝化能力要優(yōu)于羧甲基纖維素；對(duì)于處理量為60L?d1的復(fù)合垂直流人工濕地最佳的葡萄糖投加量為1.5g；在進(jìn)水前4h投加碳源要優(yōu)于進(jìn)水時(shí)加入碳源。魏星等認(rèn)為，補(bǔ)充植物秸稈后，可以解除由于有機(jī)碳源不足產(chǎn)生的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮積累，提高總氮的去除效率。

2.3 pH值

一般認(rèn)為，當(dāng)pH值在7.0～8.0時(shí)，有利于好氧和厭氧微生物對(duì)含氮有機(jī)物的氨化作用的發(fā)生，此時(shí)亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌活動(dòng)增強(qiáng)，硝化作用占主導(dǎo)地位；pH>8.0時(shí)，氨氮的揮發(fā)作用占主導(dǎo)地位；pH

2.4溶解氧

有研究表明，當(dāng)水中DO0.2mg/L時(shí)，反硝化作用受到抑制。在除磷過(guò)程中，厭氧條件通常與濕地中磷的釋放有關(guān)，而好氧條件與濕地中磷濃度的降低有關(guān)。陶敏等的研究表明，氧調(diào)控下微生物群落向基質(zhì)縱深發(fā)展，微生物量明顯增加；表征微生物活性的PLFAs總不飽和度水平顯著升高。

3.結(jié)語(yǔ)與展望

微生物群落是人工濕地污水凈化的主要承擔(dān)者，在污染物的去除過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而目前對(duì)濕地微生物種群特性及其調(diào)控技術(shù)方面的研究仍相對(duì)較少，因此，根據(jù)目前的人工濕地微生物種群研究現(xiàn)狀，筆者認(rèn)為今后可重點(diǎn)開(kāi)展如下研究：（1）篩選、馴化人工濕地功能微生物，特別是針對(duì)重金屬污水、油田廢水、養(yǎng)殖廢水等特殊污水中功能微生物的開(kāi)發(fā)與利用以強(qiáng)化體系的凈化能力。（2）通過(guò)液態(tài)、固態(tài)培養(yǎng)基交替培養(yǎng)純化，馴化出在低溫條件下仍能保持較強(qiáng)活性的耐冷硝化菌株，使硝化過(guò)程在冬天較低溫度條件下仍可正常進(jìn)行，從而提高濕地在低溫條件下的脫氮效果?？傊?，加強(qiáng)濕地微生物群落特征和調(diào)控技術(shù)研究，既能為濕地生態(tài)技術(shù)奠定微生物學(xué)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)有利于指導(dǎo)人工濕地的設(shè)計(jì)、運(yùn)行和管理，這對(duì)于今后濕地污水凈化技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新有著十分重要的意義。

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篇9

研究方法

本研究通過(guò)實(shí)地觀測(cè)獲得環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),并綜合運(yùn)用生態(tài)學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)理論方法,對(duì)“綠色南京”林業(yè)工程新增林的主要生態(tài)功能及價(jià)值進(jìn)行研究分析,結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù),選取適宜的評(píng)價(jià)指標(biāo)構(gòu)建評(píng)價(jià)指標(biāo)體系,確定評(píng)價(jià)方法,定量分析和評(píng)估“綠色南京”林業(yè)工程建設(shè)10年來(lái)新增林的碳氧平衡、水土保持、凈化空氣、生物多樣性保護(hù)、森林游憩等主要生態(tài)服務(wù)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1調(diào)查與測(cè)定方法

1.1空氣質(zhì)量2012年6月22~24日先后測(cè)定南京化學(xué)工業(yè)園區(qū)和揚(yáng)子石化周邊的六合葛塘和平莊山莊組（樣點(diǎn)Ⅰ）、六合葛塘新華路（樣點(diǎn)Ⅱ）和六合長(zhǎng)蘆河?xùn)|社區(qū)（樣點(diǎn)Ⅲ）3個(gè)樣點(diǎn)的楊樹(shù)林SO2、NO2、總懸浮顆粒物（TSP）、空氣微生物的含量,同時(shí)測(cè)定相應(yīng)的無(wú)林地對(duì)照區(qū)域。每天分為3個(gè)時(shí)段測(cè)定,分別為08:00、12:00、17:00,計(jì)算日平均值。SO2、NO2和TSP的測(cè)定參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,空氣微生物的測(cè)定參考文獻(xiàn)的方法。

1.2小氣候觀測(cè)2012年7月9~12日,分別測(cè)量長(zhǎng)江防護(hù)林（楊樹(shù)林和柳樹(shù)林）和高速公路邊楊樹(shù)林及其相應(yīng)的無(wú)林地對(duì)照區(qū)的氣溫,天氣情況為多云、無(wú)風(fēng)或微風(fēng)。每樣點(diǎn)從10:00到17:00每小時(shí)測(cè)量1次。測(cè)定時(shí)干濕球溫度計(jì)距離地面150cm,直接測(cè)定環(huán)境氣溫,用濕球溫度與干球溫度相比求得空氣相對(duì)濕度。采用TES-1352A聲級(jí)計(jì)測(cè)定噪音情況,用通風(fēng)干濕儀、QDF-3型熱球式電風(fēng)速儀、地溫表等儀器測(cè)定被測(cè)樣地內(nèi)和對(duì)照樣地的氣溫、地溫（0、5、10、15、20cm）、相對(duì)濕度、平均風(fēng)速。

1.3生物多樣性測(cè)定林下生物多樣性主要包括林下植物和動(dòng)物。選擇“綠色南京”建設(shè)典型樣地,每個(gè)樣地設(shè)16個(gè)樣方（重復(fù)）,樣方內(nèi)記錄林木的胸徑、高度、冠幅,并調(diào)查、測(cè)定林下植被的種類和生物量。林下動(dòng)物（昆蟲(chóng)、蜘蛛等）主要采用掃網(wǎng)法、陷阱法、每株調(diào)查法、直接捕捉計(jì)數(shù)法等方法,野外采集,室內(nèi)鑒定分析;土壤生物多樣性主要包括地表凋落物中的節(jié)肢動(dòng)物、土壤線蟲(chóng)、土壤原生動(dòng)物和土壤微生物,通過(guò)野外采集、室內(nèi)鑒定分析;鳥(niǎo)類生物多樣性主要通過(guò)實(shí)地調(diào)查的形式來(lái)完成,在一定的時(shí)間和一定的范圍內(nèi)觀測(cè)鳥(niǎo)的種類和數(shù)量,定性和定量相結(jié)合。

2生態(tài)價(jià)值計(jì)算方法

2.1碳氧平衡價(jià)值“綠色南京”工程主要栽種的為楊樹(shù)、廣玉蘭、香樟、雪松等,且大多在2003~2006年栽種。以楊樹(shù)為例，通過(guò)野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)2012年8月楊樹(shù)胸徑大多在20cm左右,樹(shù)干高6m左右,密度500棵/hm2,目前新增林地面積約55000hm2。經(jīng)計(jì)算得出,截至2011年新增林的木材總蓄積量為197萬(wàn)m3。根據(jù)木材蓄積量計(jì)算固碳釋氧的總量,最后根據(jù)碳稅法和工業(yè)制氧價(jià)格分別計(jì)算固碳和釋放氧氣的經(jīng)濟(jì)效益。

2.2吸收SO2價(jià)值《中國(guó)生物多樣性經(jīng)濟(jì)價(jià)值評(píng)估》顯示,針葉林對(duì)SO2的吸收能力為215.6kg/hm2、闊葉林為88.65kg/hm2,由于“綠色南京”新增林絕大部分為闊葉林,因此新增林對(duì)SO2的吸收能力按照100kg/hm2計(jì)算。在我國(guó)SO2的治理費(fèi)用為0.6元/kg。吸收SO2的價(jià)值=0.6元/kg×100kg/hm2×林地面積（hm2）

2.3吸收NO2價(jià)值當(dāng)?shù)趸锏陌l(fā)生量為106.7萬(wàn)t時(shí),林木的吸收量為6.0kg/hm2,可能的吸收率為3.5%。吸收NO2的價(jià)格采用中國(guó)大氣污染物籌資型排污收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)的平均值（1.34元/kg）。吸收NO2價(jià)值=1.34元/kg×6.0kg/hm2×森林面積（hm2）

2.4滯塵價(jià)值一般而言,闊葉林的滯塵能力為10.11t/hm2,針葉林為33.2t/hm2。由于“綠色南京”林業(yè)工程新增林大部分為楊樹(shù)等闊葉樹(shù),因此滯塵能力為10.11t/hm2。阻滯降塵的價(jià)格采用燃煤爐窯大氣污染物排污收費(fèi)的平均值,即0.56元/kg。滯塵價(jià)值=0.56元/kg×10.11t/hm2×闊葉林面積（hm2）

2.5降噪價(jià)值根據(jù)防護(hù)林對(duì)交通噪音的降噪效果,采用替代法,對(duì)林地降噪的生態(tài)經(jīng)濟(jì)價(jià)值進(jìn)行估算。即按照目前市場(chǎng)上隔音板價(jià)格及隔音效果,換算出減弱噪音的單價(jià)是50元/（dB•m）,其中m是隔音板的長(zhǎng)度,換算成等效減噪林帶,計(jì)算公式為:降噪價(jià)值（W）=林帶長(zhǎng)度（L）×植被減弱噪音單位價(jià)格（C）×減弱噪音分貝。

2.6凈化空氣微生物價(jià)值V0=aTq（1/K-1）式中:V0為森林凈化空氣微生物的價(jià)值;a為凈化空氣微生物價(jià)值占森林總生態(tài)價(jià)值的比例系數(shù)（通過(guò)調(diào)查評(píng)價(jià)和專家評(píng)議為15%）;T為森林立木價(jià)格（樹(shù)干為800元/m3）;q為林木蓄積量;K為森林直接實(shí)物性使用價(jià)值占森林有形和無(wú)形總價(jià)值的比例系數(shù),一般按10%計(jì)算。

2.7涵養(yǎng)水源價(jià)值采用降水儲(chǔ)存量估算模型計(jì)算涵養(yǎng)水源價(jià)值,森林截留的降水量占總降水量的50%,水的成本為1元/t。涵養(yǎng)水源價(jià)值=年平均降水量（1200mm）×森林面積×50%×水價(jià)（1元/t）

2.8固土保肥價(jià)值J=k•S•g•d式中：J為固土效能經(jīng)濟(jì)評(píng)價(jià)值（元）,即防止泥土流失的效益值;k為挖取泥沙費(fèi)用（1.5元/t）;S為森林總面積（hm2）;g為進(jìn)入河道或水庫(kù)中的泥沙占總泥沙流失量的比值（1/2）;d為有林地比無(wú)林地減少的侵蝕量（0.003685t/m3）。保肥效益僅計(jì)算N、P、K3種主要養(yǎng)分的損失量,將土壤中純N、P、K分別換算成尿素、過(guò)磷酸鈣和氯化鉀的量。采用公式I=d×S×∑P1P2P3計(jì)算。式中:I為森林保肥效益值（元）;d為有林地比無(wú)林地減少的侵蝕量（0.003685t/m3）;S為森林總面積（59237hm2）;P1為林區(qū)土壤中N、P、K含量,分別為0.090%、0.054%、1.55%,N、P、K的含量通過(guò)野外不同林地種類的土壤采樣,室內(nèi)分析計(jì)算得來(lái);P2表示純N、P、K折成化肥（尿素、過(guò)磷酸鈣、氯化鉀）的比例,分別為60/28、506/62、75.5/39;P3為各類化肥在當(dāng)?shù)氐匿N售價(jià),尿素、過(guò)磷酸鈣、氯化鉀平均價(jià)格分別為1800元/t、460元/t和2200元/t。

2.9生物多樣性保護(hù)價(jià)值采用生物多樣性指數(shù)計(jì)算森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)生物多樣性的功能。森林對(duì)生物物種資源的保護(hù)價(jià)值采用U=S•A計(jì)算。式中:U為生物多樣性保護(hù)價(jià)值;S為單位面積森林年生物物種資源保護(hù)價(jià)值,根據(jù)Shan-non-Wiener指數(shù)（H′）得出“綠色南京”林業(yè)工程新增林中,經(jīng)濟(jì)林單位面積的生物多樣性保護(hù)價(jià)值為6000元/hm2,其他林地平均為3萬(wàn)元/hm2;A為林地面積（hm2）。

結(jié)果與分析

1碳氧平衡作用樹(shù)木作為生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者,在吸收CO2的同時(shí)釋放O2,給人們帶來(lái)了巨大的效益,是城市森林的最基本的生態(tài)服務(wù)。采用碳稅法（即向大氣排放CO2的稅費(fèi)）計(jì)算固定CO2的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,固定CO2率即CO2340元/t。根據(jù)活立木的蓄積量計(jì)算出2011年吸收CO2的量為202萬(wàn)t其經(jīng)濟(jì)價(jià)值為9.87億元。采用工業(yè)制氧價(jià)格（400元/t）來(lái)計(jì)算植物釋放O2的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。根據(jù)活立木的蓄積量計(jì)算出2011年釋放的O2量為149萬(wàn)t其經(jīng)濟(jì)價(jià)值為6.95億元。最后得出2011年“,綠色南京”工程碳氧平衡的經(jīng)濟(jì)價(jià)值為16.82億元。然后根據(jù)每年的林木蓄積量計(jì)算出“綠色南京”林業(yè)工程實(shí)施10年新增林的碳氧平衡的總價(jià)值為42.73億元。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

2對(duì)空氣質(zhì)量的影響

2.1吸收空氣中SO2、NO2和TSP由表1可見(jiàn),3個(gè)樣點(diǎn)林地內(nèi)的空氣SO2濃度均低于林地外,林地內(nèi)和林地外的空氣SO2濃度均在0.01~0.02mg/m3之間,均達(dá)到國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（≤0.05mg/m3）。與SO2一樣,3個(gè)樣點(diǎn)林地內(nèi)的NO2的濃度均低于林地外,且林地內(nèi)和林地外的空氣NO2濃度均達(dá)到國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（≤0.08mg/m3）。3個(gè)樣點(diǎn)林地內(nèi)的TSP含量分別為0.16、0.18、0.11mg/m3,均低于林地外,3個(gè)區(qū)域的楊樹(shù)林滯塵率分別為28%、36%、15%。提示林地可以減少空氣中的SO2、NO2和TSP含量,改善空氣質(zhì)量。通過(guò)前面的方法計(jì)算出“:綠色南京”林業(yè)工程實(shí)施10年新增林吸收SO2、氮氧化物和滯塵價(jià)值分別為25.63億元、7400萬(wàn)元和27.95億元。

2.2凈化空氣微生物3個(gè)樣點(diǎn)林地內(nèi)外的細(xì)菌、真菌和放線菌含量均處于清潔到微污染的范圍內(nèi)?？諝馕⑸镏芯约?xì)菌含量最高,范圍為40%~90%。植物可以通過(guò)其本身滯塵、防風(fēng)和吸附等作用減少空氣中的微生物數(shù)量,但本研究結(jié)果得出林地內(nèi)的空氣微生物含量要高于林地外,這是由于夏季林地內(nèi)濕度較大,有利于空氣中微生物的生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致林地內(nèi)空氣微生物含量的增加。若林地衛(wèi)生狀況較差,如垃圾堆積等,則很有可能增加空氣中微生物的含量,因而要加強(qiáng)對(duì)林地的管理,保證林地清潔、衛(wèi)生的空氣環(huán)境。而林地外的空氣干燥,溫度較高,紫外線強(qiáng),不利于微生物的繁殖。通過(guò)計(jì)算,得出“綠色南京”林業(yè)工程實(shí)施10年新增林凈化空氣微生物作用產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值為81.29億元。

2.3降噪作用由表2可見(jiàn),機(jī)場(chǎng)高速的景觀綠化及防護(hù)林帶具有十分顯著的降噪效果。距離機(jī)場(chǎng)高速越遠(yuǎn),噪音值越小。機(jī)場(chǎng)高速防護(hù)林外側(cè)噪音指標(biāo),全部達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許范圍。根據(jù)防護(hù)林對(duì)交通噪音的降噪效果,計(jì)算出“綠色南京”林業(yè)工程實(shí)施10年新增林的降噪總價(jià)值為16.26億元。

對(duì)小氣候環(huán)境的影響

1降溫增濕以機(jī)場(chǎng)高速邊的林地內(nèi)外對(duì)比情況來(lái)說(shuō)明林地的小氣候效應(yīng)。對(duì)8年林齡的楊樹(shù)林觀測(cè)表明,夏季白天防護(hù)林有較為明顯的降溫效果,觀測(cè)時(shí)段內(nèi)平均溫度降低1~2℃,其中12:00~16:00時(shí)近2℃。同樣,防護(hù)林還可以降低地溫,地表溫度降低幅度最大,高達(dá)15~30℃,其他深度（5、10、15、20cm）平均降幅為3~5℃。此外,防護(hù)林可以提高相對(duì)濕度10%~30%。長(zhǎng)江防護(hù)林的楊樹(shù)林和柳樹(shù)林的觀測(cè)結(jié)果趨勢(shì)和高速公路防護(hù)林相近。

2降低風(fēng)速由圖1可見(jiàn),防護(hù)林對(duì)降低風(fēng)速有顯著作用,平均降低風(fēng)速約1m/s。

生物多樣性保護(hù)價(jià)值

1植物多樣性“綠色南京”林業(yè)工程建設(shè)的新增林地在保護(hù)生物多樣性方面的作用非常明顯。造林后自然演替的林地物種豐富度比人為干擾的林地高,種群結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。經(jīng)過(guò)6~8年的演替,已經(jīng)或正在形成新的群落結(jié)構(gòu),由于林地的生長(zhǎng)發(fā)育,林地的郁閉度增加,林下陽(yáng)光輻射減少,林下植被的總類和生物量與2005年的調(diào)查相比有所下降,但同時(shí)也有新的木本植物生長(zhǎng),進(jìn)一步優(yōu)化了林地的群落結(jié)構(gòu)。人工林栽后自然演替的最初回歸的鄉(xiāng)土木本植物有構(gòu)樹(shù)、桑、楝樹(shù)、烏桕、榆、野薔薇、白杜、柘樹(shù)、泡桐等,還包括歸化種刺槐、楓楊等。

2鳥(niǎo)類和其他動(dòng)物多樣性鳥(niǎo)類以白鷺、野雞、鷗類、椋鳥(niǎo)、燕子、喜鵲、麻雀等較為常見(jiàn)。哺乳類野生動(dòng)物主要有野兔和野豬。

3土壤生物多樣性3個(gè)樣點(diǎn)林地內(nèi)共有節(jié)肢動(dòng)物27目,總體個(gè)數(shù)1309,真螨目在各林地均占到了所有節(jié)肢動(dòng)物總量的70%左右。此外,鞘翅目、彈尾目、雙翅目、等足目、寄螨目、等翅目、膜翅目、半翅目、雙翅目幼蟲(chóng)、鱗翅目幼蟲(chóng)也較多,占整體數(shù)量的1%~5%,為林地的常見(jiàn)類群。土壤線蟲(chóng)平均密度為3.21頭/g干土,其中植食線蟲(chóng)和食細(xì)菌線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群,密度最大;土壤原生動(dòng)物的平均密度為6103頭/g干土,其中鞭毛蟲(chóng)比例最大（70%~90%）,其次為變形蟲(chóng),而纖毛蟲(chóng)比例最?。?%~5%）;與無(wú)林地相比,林地改變了土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。經(jīng)計(jì)算“,綠色南京”林業(yè)工程新增林的生物多樣性總價(jià)值為71.11億元。

4涵養(yǎng)水源和固土保肥價(jià)值涵養(yǎng)水源是林地的重要生態(tài)功能之一,屬于非消耗性的利用價(jià)值。林地被稱為“綠色的海洋”“看不見(jiàn)的水庫(kù)”。林地通過(guò)林冠截留、枯枝落葉層和其他植被對(duì)地面的保護(hù),能大大削弱雨水對(duì)地面的侵蝕,提高地表的吸水性能,減小地表徑流對(duì)土壤的沖刷,從而保護(hù)土壤,減少土壤侵蝕,達(dá)到固土保肥作用。通過(guò)計(jì)算得出“,綠色南京”林業(yè)工程新增林地涵養(yǎng)水源和固土保肥經(jīng)濟(jì)價(jià)值分別為29.64億元和12.75億元。

5森林游憩價(jià)值森林游憩價(jià)值是森林多重價(jià)值的重要組成部分,也是森林經(jīng)營(yíng)的重要目標(biāo)之一。森林為人類提供美麗的自然風(fēng)景和旅游景觀,與人類的生活、居住、娛樂(lè)等休戚相關(guān)。根據(jù)南京市林業(yè)局已有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),再結(jié)合實(shí)際情況,最終按照每個(gè)公園和森林農(nóng)莊年收益分別為700萬(wàn)元和50萬(wàn)元計(jì)算“,綠色南京”林業(yè)工程主要新增公園和森林農(nóng)莊的年均收益共計(jì)4.31億元,因此“綠色南京”林業(yè)工程實(shí)施10年來(lái)的總收入為43.10億元。

6生態(tài)效益價(jià)值總體評(píng)價(jià)由表3可見(jiàn),2002~2012年“綠色南京”林業(yè)工程新增森林的生態(tài)效益總價(jià)值為351.15億元,平均35億元/年。其中,凈化空氣微生物價(jià)值最大,為81.29億元,占生態(tài)服務(wù)總價(jià)值的23.15%;其次是生物多樣性保護(hù)價(jià)值,為71.11億元,占生態(tài)服務(wù)總價(jià)值的20.25%;森林游憩、碳氧平衡價(jià)值也較大,分別占生態(tài)服務(wù)總價(jià)值的12.26和12.17%;生物多樣性保護(hù)價(jià)值和碳氧平衡價(jià)值占了生態(tài)服務(wù)總價(jià)值的近50%。但不同的研究所得出的結(jié)果相差很大,胡海勝研究得出森林游憩價(jià)值最大,占總價(jià)值的65%左右;鄧燔（2007）認(rèn)為森林生物多樣性保護(hù)價(jià)值最大,占了整體總價(jià)值的42%。這與不同森林的主要生態(tài)服務(wù)重點(diǎn)不同有關(guān),例如,高速公路邊森林的生態(tài)服務(wù)主要以降噪為主,森林公園的生態(tài)服務(wù)主要以休閑游憩為主;其次還與不同的研究者所采用的評(píng)估方法不同有關(guān)。

篇10

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)植酸酶玉米；根際微生物；秸稈還田；多樣性

中圖分類號(hào)：S154.38文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）03-0071-05

植酸酶（phytase）是一種新型的、可作為動(dòng)物飼料添加劑的重要酶制劑，是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類酶的總稱，具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，能夠分離植酸分子中的磷，將植酸（鹽）降解為肌醇和無(wú)機(jī)磷，同時(shí)釋放出與植酸（鹽）結(jié)合的其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究表明植酸酶可以降解玉米、大豆中含有的植酸磷，釋放可被動(dòng)物利用的無(wú)機(jī)磷，提高飼料中磷的利用率，減少飼料中磷酸氫鈣的添加量，降低飼料成本；植酸酶還能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，減輕因動(dòng)物高磷糞便所導(dǎo)致的環(huán)境水域的磷污染[1]。

近年來(lái)隨著轉(zhuǎn)基因玉米的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)植酸酶玉米已步入商品化生產(chǎn)領(lǐng)域，其安全性問(wèn)題日益受到重視[2]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的安全性檢測(cè)主要集中在食品安全性方面，雖然轉(zhuǎn)植酸酶玉米表達(dá)的植酸酶本身對(duì)動(dòng)物及人體不會(huì)產(chǎn)生危害，但是轉(zhuǎn)基因植物中抗性標(biāo)記及外源基因的引入會(huì)產(chǎn)生基因水平的轉(zhuǎn)移和突變[3]。轉(zhuǎn)植酸酶玉米種植過(guò)程中，植酸酶可通過(guò)根系分泌物、秸稈還田、殘茬分解以及花粉飄落等進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)并積累和富集，可能會(huì)影響土壤微生物群體的組成和結(jié)構(gòu)，還可能改變土壤的微生物多樣性[5，6]。因此，研究轉(zhuǎn)植酸酶玉米對(duì)土壤微生物群落及多樣性的影響對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶玉米的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)有著極為重要的意義。

目前，國(guó)內(nèi)外大部分轉(zhuǎn)植酸酶玉米的研究多局限于溫室內(nèi)或人工培養(yǎng)條件下，在自然條件下研究較少。而土壤是復(fù)雜的基質(zhì)，不同地域的土壤生態(tài)環(huán)境有可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同的影響，因此溫室內(nèi)或人工培養(yǎng)條件難以真實(shí)地反映轉(zhuǎn)植酸酶玉米與根際微生物之間的關(guān)系。本試驗(yàn)主要在大田自然條件下進(jìn)行，研究轉(zhuǎn)植酸酶玉米對(duì)土壤根際可培養(yǎng)微生物和細(xì)菌生理群多樣性影響，有助于直觀地表現(xiàn)土壤微生態(tài)系統(tǒng)中的群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，以及從群落角度科學(xué)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種植的土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，以及為轉(zhuǎn)植酸酶玉米土壤生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料

玉米品種為轉(zhuǎn)植酸酶玉米奧瑞金（品種為10TPY005），非轉(zhuǎn)植酸酶親本玉米（蠡玉35）及鄭單958作為對(duì)照。1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)位于東平試驗(yàn)田內(nèi)，土壤為褐土，有機(jī)質(zhì)含量22.09 g/kg ，堿解氮含量32.44 mg/kg，速效磷含量9.82 mg/kg，速效鉀含量90.56 mg/kg，pH為8.3。試驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)植酸酶玉米（奧瑞金）、非轉(zhuǎn)植酸酶玉米（蠡玉35）和空白對(duì)照（鄭單958）3個(gè)處理，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，除空白對(duì)照外重復(fù)3次，小區(qū)面積15 m×15 m，株距20 cm，行距60 cm。玉米生育過(guò)程中不施肥不噴灑農(nóng)藥，其他按常規(guī)管理。

玉米于2011年7月10日播種， 10月22日收獲。期間在玉米苗期（7月21日）、拔節(jié)期（8月17日）、喇叭口期（8月25日）、抽雄期（8月31日）、抽絲期（9月7日）、乳熟期（10月17日）采用五點(diǎn)取樣法，分別取樣，每小區(qū)取接近玉米根際土樣5個(gè)，取樣深度15 cm左右，輕輕去除2 cm表層土，將剩下的土放入滅菌封口袋中做好標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室，-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>